Summary

Analyses Cell Lineage et des études de fonction de gènes à l'aide Twin-tache marcm

Published: March 02, 2017
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Summary

Ici, nous présentons un protocole pour une technique de marquage mosaïque qui permet la visualisation des neurones dérivées d'une cellule progénitrice commune en deux couleurs distinctes. Ceci facilite l'analyse de la lignée neuronale avec la capacité des neurones individuels naissance à jour et de la fonction du gène à étudier dans les mêmes neurones de différents individus.

Abstract

M osaic un nalyse avec un r epressible c ell m arker (marcm) est un système d'étiquetage de la mosaïque positive qui a été largement appliqué dans les études neurobiologiques de drosophile pour représenter morphologies complexes et de manipuler la fonction des gènes dans les sous – ensembles de neurones au sein autrement non marqué et non perturbé organismes. mosaïques génétiques générées dans le système de marcm sont médiés par une recombinaison site-spécifique entre les chromosomes homologues au sein de la division des cellules précurseurs afin de produire à la fois des clones marqués (marcm) et des cellules filles non marquées au cours de la mitose. Une extension de la méthode de marcm, appelé bi-place marcm (tsMARCM), étiquettes à la fois des cellules jumeaux issus d'un ancêtre commun avec deux couleurs distinctes. Cette technique a été développée pour permettre la récupération des informations utiles à partir des deux hémi-lignées. En analysant en détail les différentes paires de clones tsMARCM, le système permet tsMARCM haute résolution lignage neuronal Mapping pour révéler la naissance ordre exact des neurones marqués produites à partir de cellules progénitrices communes. En outre, le système tsMARCM étend également des études de fonction de gène en permettant l'analyse phénotypique des neurones identiques de différents animaux. Ici, nous décrivons comment appliquer le système de tsMARCM pour faciliter les études de développement neural chez la drosophile.

Introduction

Le cerveau, composé d'un grand nombre et la diversité des types de neurones, dote les animaux avec la capacité de percevoir, de traiter et de répondre aux défis du monde extérieur. Neurones de la drosophile adulte cerveau central sont dérivés d'un nombre limité de cellules souches neuronales, appelées neuroblastes (NBS), au cours du développement 1, 2. La plupart des NBs participants dans le cerveau neurogenèse chez la drosophile subissent la division asymétrique pour générer NBs d'auto-renouvellement et les cellules ganglionnaires mères (MGC), et les CMG ensuite passer par une autre série de division pour produire deux cellules filles qui se différencient en neurones 3 (figure 1A ). En raison de la complexité de la morphologie neuronale et les défis associés à l'identification des neurones spécifiques, une technologie d'étiquetage mosaïque positif, l'analyse de la mosaïque avec un marqueur cellulaire répressible (marcm), a été inventé pour permettre à l'visualization d'un seul neurone ou un petit sous – ensemble de neurones de la population de neurones environnants non marqués 4.

Marcm utilise la flippase (FLP) / système cible de reconnaissance de FLP (FRT) pour médier une recombinaison site-spécifique entre les chromosomes homologues dans une cellule précurseur de séparation portant un allèle hétérozygote d'un gène répresseur, dont l' expression normalement inhibe l'expression d'un gène rapporteur 4. Après la division mitotique des chromosomes recombinants sont isolés dans des cellules jumelles, de telle sorte qu'une cellule contient des alleles homozygotes du gène répresseur et l'autre cellule n'a pas de gène répresseur expression du rapporteur dans la cellule (et ses descendants) ne soit plus 4 bloqué. Trois modèles clonales sont habituellement trouvés dans une expérience de marcm quand FLP est induit stochastiquement en NBs ou CMG: une seule cellule et deux cellules-GMC clones, qui représentent la morphologie neuronale au resolutio une seule cellulen, et multi-cellulaire-NB clones, qui révèlent entiers modèles morphologiques de neurones dérivés d'un NB commun (figure 1B). La technique de marcm a été largement appliquée dans des études neurobiologiques de Drosophila, y compris l'identification du type de neurones permettant de reconstruire des réseaux de câblage du cerveau entier, des analyses de la lignée neuronale de la divulgation de l'histoire du développement des neurones, la caractérisation phénotypique des fonctions de gènes impliqués dans la spécification du destin cellulaire et la morphogenèse neuronale et étudie la différenciation 5, 6, 7, 8, 9, 10. Étant donné que les étiquettes classiques marcm une seule des deux cellules filles (et les lignées) après l'événement de recombinaison mitotique induite, des informations potentiellement utiles depuis le côté non marqué est perdue. Cette limitation empêche l'application de la base MSystème ARCM à haute résolution analyse de nombreuses lignées neurales qui changent le destin des cellules dans le tempo rapide ou à la précision des analyses des fonctions des gènes dans les neurones identiques de différents animaux 11, 12.

Twin-tache marcm (tsMARCM) est un système avancé qui marque les neurones dérivés d'un ancêtre commun avec deux couleurs distinctes, ce qui permet la récupération des informations utiles à partir des deux côtés des cellules jumeaux, surmontant ainsi la limitation du système marcm 11 initial ( Figure 2A2C). Dans le système tsMARCM, deux ARN interférence (ARNi) à base suppresseurs sont situés au trans-sites de chromosomes homologues dans une cellule précurseur, et l'expression de ces suppresseurs inhibent l'expression indépendamment de leurs reporters respectifs (figure 2B). Après mitotique recombinaison spécifique de site à médiation par le système FLP / FRT, le twsuppresseurs à base RNAi-o devenus séparés en cellules doubles pour permettre l'expression des journalistes distincts (figure 2B). Deux modèles clonales, une seule cellule associée à des clones monocellulaires et deux cellules-GMC associés aux clones multicellulaire-NB, sont généralement considérés dans une expérience tsMARCM (figure 2C). Informations dérivé d'un côté des cellules jumelles peuvent être utilisées comme référence pour l'autre côté, ce qui permet à haute résolution des analyses lignage neural, telles que la naissance à jour des neurones marqués, et analyse phénotypique des neurones identiques dans différents animaux pour l'enquête précise la fonction du gène de neurones 11, 12. Ici, nous présentons un protocole étape par étape décrivant la façon de mener une expérience tsMARCM, qui peut être utilisé par d' autres laboratoires d'élargir leurs études sur le développement neuronal (ainsi que le développement d'autres tissus, le cas échéant) chez la drosophile.

Protocol

1. Construire tsMARCM-ready Flies Utilisation du Requis transgènes 11, 13 Générer la version originale de mouches tsMARCM-prêt de transgènes qui sont transportés par les mouches individuelles 11 (voir le tableau 1). Effectuer génétiques schémas de passage des mouches standard, qui ont été décrites précédemment, en mettant plusieurs transgènes dans les mêmes stocks de mouches 13…

Representative Results

Le système tsMARCM a été utilisé pour faciliter l'analyse et la lignée neuronale études de la fonction génique en récupérant des informations importantes sur les neurones dérivés de NBs communs. Le système a été utilisé pour identifier la plupart (sinon tous) types de neurones, déterminer le nombre de cellules de chaque type neuronal, et déterminer la naissance ordre de ces neurones 11, 12, <sup cl…

Discussion

Étapes critiques dans le Protocole

Les étapes 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, et 3.2 sont essentiels pour obtenir de bons résultats de tsMARCM. Les conducteurs de -GAL4 spécifiques de tissus qui n'expriment pas GAL4 dans les progéniteurs neuraux sont préférées pour les étapes 1.1.1 et 1.2.1. Éviter le surpeuplement des animaux cultivés dans les flacons fly-alimentaires à l'étape 2.3. Parce que le temps de latence d'induction, le niveau d'expression de FLP lors de c…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le Ministère de la Science et de la Technologie (MOST 104-2311-B-001-034) et l'Institut de biologie cellulaire et Organismic, Academia Sinica, Taiwan.

Materials

Carbon dioxide (CO2) Local vendor n.a. Anesthetize flies
CO2 pad Local vendor n.a. Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4 Uniregion Bio-Tech (or other vendors) PBS001 Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549 Fix fly brains
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat Jackson ImmunoResearch  005-000-121 Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody Invitrogen MCD0800 Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody Clonetech 632496 Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Invitrogen A11006 Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546 Invitrogen A11035 Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent Molecular Probes S36936 Mount fly brains and protect quenching of fluorescence 
PYREX 9 depression glass spot plate Corning 7220-85 Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit World Precision Instruments SYLG184 Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal Sigma-Aldrich 242276-250G Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-30 Dissect and mount fly brains
Micro slide Corning 2948-75×25 Mount fly brains
Micro cover glass No.1.5 VWR International 48366-205 Mount fly brains
Nail polish Local vendor not available Seal micro cover glass on micro slides
Incubator  Kansin Instruments LTI603 culture flies at 25°C
(or other vendors)
Water bath Kansin Instruments WB212-B2 Induce heat-shock in flies at 37°C
(or other vendors)
Orbital shaker Kansin Instruments OS701 Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope Leica EZ4 Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope Zeiss (or other vendors) LSM 700 (or other models) Image tsMARCM clones
image-processing software 1
(e.g., Zeiss LSM image browser) 
Zeiss not available Project stacks of confocal images
image-processing software 2
(e.g., Image-J) 
not available not available Count cell number of tsMARCM clones

Referências

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Citar este artigo
Shen, H., Hsu, T., Chung, P., Yu, H. Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM. J. Vis. Exp. (121), e55278, doi:10.3791/55278 (2017).

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