تحليل النسب الخلية ودراسات وظائف الجينات عن طريق التوأم بقعة MARCM
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لمعدات وضع العلامات الفسيفساء الذي يسمح التصور من الخلايا العصبية المشتقة من خلية سلفية مشتركة في لونين مميزة. هذا يسهل تحليل النسب العصبية لديها القدرة على الخلايا العصبية الفردية التي يرجع تاريخها ولادة ودراسة وظيفة الجين في نفس الخلايا العصبية من مختلف الأفراد.
Abstract
M osaic على nalysis مع ص epressible ج الذراع م arker (MARCM) هو عبارة عن فسيفساء نظام وضع العلامات الإيجابية التي تم تطبيقها على نطاق واسع في الدراسات العصبية ذبابة الفاكهة لتصوير الأشكال التضاريسية معقدة والتلاعب وظيفة الجينات في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية داخل إنفراد خلاف ذلك، ورابط الجأش الكائنات الحية. وتتوسط الفسيفساء الوراثية الناتجة في النظام MARCM من خلال إعادة التركيب في مواقع محددة بين الكروموسومات المتجانسة داخل الخلايا المنقسمة تمهيدا لإنتاج كلا ملحوظ (استنساخ MARCM) والخلايا الوليدة لا تحمل علامات مميزة خلال الانقسام. امتدادا للطريقة MARCM، ودعا التوأم بقعة MARCM (tsMARCM)، والعلامات كلا من الخلايا التوأم مستمدة من سلف مشترك مع اثنين من ألوان مختلفة. وقد تم تطوير هذه التقنية لتمكين استرجاع المعلومات المفيدة من كلا نصفي الأنساب. من خلال تحليل شامل أزواج مختلفة من الحيوانات المستنسخة tsMARCM، يسمح نظام tsMARCM عالية الدقة النسب العصبي mappinز لتكشف بالضبط ولادة النظام من الخلايا العصبية المسماة المنتجة من الخلايا الاولية المشتركة. وعلاوة على ذلك، فإن النظام tsMARCM يمتد أيضا الدراسات وظيفة الجين من خلال السماح للتحليل المظهري من الخلايا العصبية متطابقة من الحيوانات المختلفة. هنا، نحن تصف كيفية تطبيق نظام tsMARCM لتسهيل دراسات التنمية العصبية في ذبابة الفاكهة.
Introduction
الدماغ، تتألف من عدد كبير وأنواع مختلفة من الخلايا العصبية، يمنح الحيوانات مع القدرة على إدراك، عملية، والاستجابة للتحديات من العالم الخارجي. وتستمد الخلايا العصبية في الدماغ الكبار ذبابة الفاكهة المركزي من عدد محدود من الخلايا الجذعية العصبية، ودعا neuroblasts (مصلحة الدولة للاحصاء)، أثناء التطور 1 و 2. أكثر من مصلحة الدولة للاحصاء المشاركة في تكوين الخلايا العصبية في الدماغ في ذبابة الفاكهة الخضوع لتقسيم غير المتماثلة لتوليد مصلحة الدولة للاحصاء تجديد الذات وخلايا العقدة الأم (شهامة)، وشهامة ثم تذهب من خلال جولة أخرى من تقسيم لإنتاج خليتين ابنة أن تفرق في الخلايا العصبية 3 (الشكل 1A ). ونظرا لتعقيد التشكل العصبية والتحديات المرتبطة بتحديد الخلايا العصبية محددة، والإيجابية الفسيفساء التكنولوجيا وضع العلامات، وتحليل الفسيفساء مع علامة الخلية كظوم (MARCM)، اخترع لتمكين visualizatأيون من الخلايا العصبية واحدة أو مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا العصبية من سكان المحيطة، الخلايا العصبية غير المسماة 4.
MARCM يستخدم flippase (FLP) / FLP الاعتراف الهدف (FRT) نظام للتوسط إعادة التركيب في مواقع محددة بين الكروموسومات المتجانسة داخل الخلية الفاصل السلائف تحمل أليل متخالف من الجين كاظمة، الذي عادة يحول دون التعبير عن الجينات مراسل 4 التعبير. بعد تقسيم الإنقسامية، يتم فصل الكروموسومات المؤتلف إلى الخلايا التوأم، مثل أن خلية واحدة تحتوي على الأليلات متماثل من الجين كاظمة وخلية أخرى لا يوجد لديه كاظمة الجينات التعبير عن مراسل في تلك الخلية (ونسله) لم يعد منعت 4. عادة ما تكون موجودة ثلاثة أنماط نسيلي في تجربة MARCM عند يسببها FLP عشوائيا في مصلحة الدولة للاحصاء أو شهامة: وحيدة الخلية واثنين من خلية GMC الحيوانات المستنسخة، التي تصور مورفولوجيا الخلايا العصبية في resolutio وحيدة الخليةن، ومتعدد الخلوي-NB الحيوانات المستنسخة، التي تكشف عن أنماط شكلية كاملة من الخلايا العصبية المستمدة من ملاحظة المشترك (الشكل 1B). وقد تم تطبيق هذه التقنية MARCM على نطاق واسع في الدراسات العصبية ذبابة الفاكهة، بما في ذلك في تحديد نوع الخلايا العصبية لإعادة إعمار شبكات الأسلاك على نطاق الدماغ، وتحليل النسب العصبية للكشف عن تاريخ التنموي من الخلايا العصبية، وتوصيف المظهري وظائف الجينات المعنية في مواصفات مصير الخلايا، والتشكل العصبية والتمايز يدرس 5، 6، 7، 8، 9، 10. لأن MARCM التقليدية تسميات واحد فقط من خليتين ابنة (والأنساب) بعد وقوع الحدث الإنقسامية إعادة التركيب التي يسببها، يتم فقدان المعلومات يمكن أن تكون مفيدة من الجانب غير المراقب. هذا القيد ما يحول دون تطبيق الأساسي Mنظام ARCM إلى عالية الدقة يحلل الكثير من الأنساب العصبية التي تبديل مصائر خلية في وتيرة سريعة أو لدقة التحليلات من وظائف الجينات في الخلايا العصبية متطابقة من مختلف الحيوانات 11 و 12.
التوأم بقعة MARCM (tsMARCM) هو نظام متطور التسميات الخلايا العصبية مشتقة من سلف مشترك مع اثنين من ألوان مختلفة، والتي تمكن من التعافي من المعلومات المفيدة من كلا الجانبين من الخلايا التوأم، وبالتالي التغلب على قيود على نظام MARCM الأصلي 11 ( الشكل 2A – 2C). في نظام tsMARCM، واثنين من الحمض النووي الريبي التدخل (رني) القائم على تقع المكثفات في مواقع المتحولة من الكروموسومات المتجانسة داخل الخلية السلائف، والتعبير عن تلك المكثفات تمنع بشكل مستقل التعبير عن صحفيين كل منها (الشكل 2B). وبعد الإنقسامية إعادة التركيب في مواقع محددة بوساطة من خلال نظام FLP / FRT، وطوماس فيبسفصلت المكثفات س أساس رني تصبح في خلايا التوأم للسماح للتعبير عن صحفيين متميزة (الشكل 2B). نمطين نسيلي، وحيدة الخلية المرتبطة استنساخ وحيدة الخلية والخلية يومين GMC المرتبطة استنساخ عديد الخلايا-NB، وينظر عادة في تجربة tsMARCM (الشكل 2C). معلومات مستمدة من جانب واحد من يمكن استخدامها كمرجع بالنسبة للجانب الآخر الخلايا التوأم، مما عالية الدقة تحليل النسب العصبي، مثل الخلايا العصبية المسماة التي يرجع تاريخها الولادة، والمظهرية ويحلل الخلايا العصبية متطابقة في الحيوانات المختلفة للتحقيق الدقيق وظيفة الجينات العصبية 11 و 12. هنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة تصف كيفية إجراء التجربة tsMARCM، والتي يمكن استخدامها من قبل مختبرات أخرى لتوسيع نطاق دراستهم التنمية العصبية (فضلا عن تطوير الأنسجة الأخرى، إن وجدت) في ذبابة الفاكهة.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
الخطوات 1.1.1، 1.2.1، 2.3، 2.5، و 3.2 حاسمة للحصول على نتائج جيدة tsMARCM. ويفضل السائقين -GAL4 الأنسجة المحددة التي لا تعبر عن GAL4 في الأسلاف العصبية للخطوات 1.1.1 و 1.2.1. تجنب الإفراط في الازدحام-الحيوانات التي تزرع ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST 104-2311-B-001-034) ومعهد الخلوية والبيولوجيا العضوية، أكاديمية سينيكا، تايوان.
Materials
| Carbon dioxide (CO2) | Local vendor | n.a. | Anesthetize flies |
| CO2 pad | Local vendor | n.a. | Sort, cross and transfer flies |
| 10x PBS pH 7.4 | Uniregion Bio-Tech (or other vendors) | PBS001 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | Fix fly brains |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Rinse, wash and immunostain fly brains |
| Normal goat | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Immunostain fly brains |
| serum | |||
| Rat anti-mouse CD8 antibody | Invitrogen | MCD0800 | Immunostain fly brains |
| Rabbit anti-DsRed antibody | Clonetech | 632496 | Immunostain fly brains |
| Mouse anti-Brp antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11006 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Immunostain fly brains |
| SlowFade gold antifade reagent | Molecular Probes | S36936 | Mount fly brains and protect quenching of fluorescence |
| PYREX 9 depression glass spot plate | Corning | 7220-85 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | 242276-250G | Make black Sylgard dishes |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Dissect and mount fly brains |
| Micro slide | Corning | 2948-75×25 | Mount fly brains |
| Micro cover glass No.1.5 | VWR International | 48366-205 | Mount fly brains |
| Nail polish | Local vendor | not available | Seal micro cover glass on micro slides |
| Incubator | Kansin Instruments | LTI603 | culture flies at 25°C |
| (or other vendors) | |||
| Water bath | Kansin Instruments | WB212-B2 | Induce heat-shock in flies at 37°C |
| (or other vendors) | |||
| Orbital shaker | Kansin Instruments | OS701 | Wash and immunostain fly brains |
| (or other vendors) | |||
| Dissection microscope | Leica | EZ4 | Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Confocal microscope | Zeiss (or other vendors) | LSM 700 (or other models) | Image tsMARCM clones |
| image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser) |
Zeiss | not available | Project stacks of confocal images |
| image-processing software 2 (e.g., Image-J) |
not available | not available | Count cell number of tsMARCM clones |
Referências
- Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain. Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).
- Yu, H. H., et al. Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain. Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).
- Goodman, C. S., Doe, C. Q., Bate, M., Arias, A. M. . The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).
- Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila. Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genética. 196 (1), 17-29 (2014).
- Zhu, S., et al. Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity. Cell. 127 (2), 409-422 (2006).
- Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons. Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).
- Yu, H. H., et al. A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
- Greenspan, R. J. . Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , (1997).
- Awasaki, T., et al. Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts. Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).
- Lee, T. Generating mosaics for lineage analysis in flies. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions. PLoS Biol. 10 (11), e1001425 (2012).
- Zhan, X. L., et al. Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).
- Griffin, R., et al. The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis. Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain. Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).
