Le analisi delle cellule lignaggio e studi la funzione del gene Impiegando doppi loco MARCM

Il cervello, costituito da un vasto numero e diversi tipi di neuroni, dota gli animali con la capacità di percepire, di processo e rispondere alle sfide provenienti dal mondo esterno. I neuroni dell'adulto Drosophila cervello centrale sono derivati da un numero limitato di cellule staminali neurali, chiamati neuroblasti (NBS), durante lo sviluppo ^{1, 2.} La maggior parte di NBS partecipare a neurogenesi cerebrale in Drosophila sottoposti divisione asimmetrica per generare NBs auto-rinnovamento e cellule madri gangliari (GMC), e le GMCs poi passare attraverso un altro giro di divisione per la produzione di due cellule figlie che si differenziano in neuroni ³ (Figura 1A ). A causa della complessità della morfologia neuronale e le sfide connesse con l'identificazione neuroni specifici, una tecnologia positiva etichettatura mosaico, analisi mosaico con un marker delle cellule reprimibile (MARCM), è stato inventato per consentire la visualizatione di un singolo neurone o un piccolo sottoinsieme di neuroni dalla popolazione di neuroni circostanti, senza etichetta ^4.

MARCM utilizza il sistema / target riconoscimento FLP (FRT) mediare ricombinazione sito-specifica tra cromosomi omologhi all'interno di una cella di divisione precursore portando un allele eterozigote di un gene repressore, la cui espressione normalmente inibisce l'espressione di un gene reporter ⁴ flippase (FLP). Dopo la divisione mitotica, i cromosomi ricombinanti sono segregati in cellule gemelle, tale che una cella contiene alleli omozigoti del gene repressore e l'altra cella ha repressore gene-espressione del reporter in quella cella (ei suoi discendenti) non è più bloccato ^4. Tre modelli clonali si trovano di solito in un esperimento MARCM quando FLP è stocasticamente indotta in NBs o GMCs: unicellulari e due celle-GMC cloni, che raffigurano la morfologia dei neuroni a resolutio cella singolan, e multi-cellulare-NB cloni, che rivelano interi modelli morfologici di neuroni derivati da una NB comune (Figura 1B). La tecnica MARCM è stato ampiamente applicato in Drosophila studi neurobiologici, compresa l'identificazione di tipo neuronale per ricostruire le reti di cablaggio in tutto il cervello, neurali lignaggio analisi per rivelare la storia dello sviluppo dei neuroni, la caratterizzazione fenotipica delle funzioni dei geni coinvolti nella determinazione del fato cellulare, e la morfogenesi neuronale e differenziazione studia ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Poiché MARCM convenzionale etichetta solo una delle due cellule figlie (e linee) dopo l'evento di ricombinazione mitotica indotta, informazioni potenzialmente utili dal lato marcato viene persa. Questa limitazione osta all'applicazione della base MSistema ARCM a ad alta risoluzione le analisi di molti lignaggi neuronali che si attivano destino delle cellule in tempo veloce o per la precisione di analisi delle funzioni dei geni nei neuroni identici di diversi animali ^{11, 12.}

Twin-loco MARCM (tsMARCM) è un sistema avanzato che etichette neuroni derivati da un progenitore comune con due colori distinti, che permette il recupero delle informazioni utili da entrambi i lati delle celle gemelle, superando la limitazione del sistema MARCM originale ¹¹ ( Figura 2A – 2C). Nel sistema tsMARCM, due interferenza RNA (RNAi) a base di soppressori sono situati trans siti di cromosomi omologhi all'interno di una cellula precursore, e l'espressione di tali soppressori inibiscono in maniera indipendente l'espressione dei rispettivi reporter (Figura 2B). A seguito di site-specific ricombinazione mitotica mediata attraverso il sistema FLP / FRT, la TWsoppressori o basati RNAi diventare segregati in cellule gemelle per consentire l'espressione del reporter distinti (Figura 2B). Due modelli clonali, cella singola associata con cloni unicellulari e due celle-GMC associati con cloni multi-cellulari-NB, sono in genere visti in un esperimento tsMARCM (Figura 2C). Informazioni derivato da un lato delle celle singoli possono essere utilizzati come riferimento per l'altro lato, consentendo ad alta risoluzione analizza neurale lineage, come nascita-incontra i neuroni marcati, e fenotipica analisi dei neuroni identici in diversi animali per l'indagine precisa della funzione del gene neurale ^{11, 12.} Qui, vi presentiamo un protocollo passo-passo che descrive come condurre un esperimento tsMARCM, che può essere utilizzato da altri laboratori per ampliare gli studi di sviluppo neurale (nonché lo sviluppo di altri tessuti, se del caso) in Drosophila.