Zell Lineage Analysen und Genfunktion Studien mit Twin-Spot MARCM

Das Gehirn, die aus einer großen Anzahl und vielfältige Arten von Neuronen, ausstattet Tiere mit der Fähigkeit, Verfahren zu erkennen und zu Herausforderungen von der Außenwelt zu antworten. Neurone des adulten Drosophila zentralen Gehirn aus einer begrenzten Anzahl von neuralen Stammzellen, die so genannte Neuroblasten (NBS) abgeleitet wird , während der Entwicklung ^{1, 2.} Die meisten der NBS in Gehirn Neurogenese in Drosophila beteiligt laufen asymmetrische Teilung selbst erneuernden NBs und Ganglion Mutterzellen (GMCs) zu erzeugen, und die GMCs dann durch eine weitere Runde der Abteilung gehen zu zwei Tochterzellen zu produzieren, die in Neuronen ³ (Abbildung 1A unterscheiden ). Wegen der Kompliziertheit der neuronalen Morphologie und die Herausforderungen im Zusammenhang mit spezifischen Neuronen identifiziert, eine positive Mosaik Etikettiertechnik, Mosaik-Analyse mit einer repressible Zellmarker (MARCM) wurde erfunden, die visualizat zu ermöglichenIon eines einzelnen Neurons oder einer kleinen Untergruppe von Neuronen aus der Bevölkerung der Umgebung, nicht markierten Neuronen ^4.

MARCM nutzt die Flippase (FLP) / FLP Erkennungsziel (FRT) System ⁴ ortsspezifische Rekombination zwischen homologen Chromosomen in einer Teilungsvorläuferzelle Durchführung eines heterozygoten Allel eines Repressor – Gen, dessen Expression normalerweise hemmt die Expression eines Reportergens zu vermitteln. Nach der mitotischen Teilung werden die rekombinanten Chromosomen in zwei Einzelzellen getrennt ist, so dass eine Zelle homozygot Allele des Repressor-Gen enthält, und die andere Zelle hat kein Repressorgen-die Expression des Reporter in dieser Zelle (und ihre Nachkommen) nicht mehr ⁴ blockiert. Drei klonalen Muster sind in der Regel in einem Experiment gefunden MARCM wenn FLP stochastisch in NBs oder GMCs induziert wird: single-cell und zweizelligen-GMC-Klone, die neuronale Morphologie auf Einzelzell resolutio darstellenn und mehrzelligen-NB – Klone, die aus einer gemeinsamen NB (1B) abgeleitet gesamten morphologischen Muster von Neuronen offenbaren. Die MARCM Technik wurde in Drosophila Neurobiologie Studien weit angewendet worden, einschließlich der neuronalen Typerkennung für die Rekonstruktion des Gehirns weiten Kabelnetze, neuronale Abstammungslinie Analysen in Zellschicksal Spezifikation und neuronalen Morphogenese die Entwicklungsgeschichte von Neuronen, phänotypischen Charakterisierung von Gen – Funktionen beteiligt für die Offenlegung von und Differenzierungsstudien ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Denn nur herkömmliche MARCM eine der beiden Tochterzellen-Etiketten (und Linien) nach der mitotischen Rekombinationsereignis induziert, möglicherweise nützliche Informationen aus der unmarkierten Seite verloren. Diese Einschränkung schließt die Anwendung der Grund MARCM System hochauflösende Analysen vieler neuronaler Linien, die Zellschicksalen in schnellem Tempo oder Präzision umschalten Analysen von Genfunktionen in identischen Neuronen verschiedener Tiere ^{11, 12.}

Twin-Spot MARCM (tsMARCM) ist ein fortschrittliches System , das von einem gemeinsamen Vorläufer mit zwei verschiedenen Farben abgeleitet Neuronen – Etiketten, die die Rückgewinnung von nützlichen Informationen von beiden Seiten der Doppelzellen ermöglicht, so dass die Begrenzung des ursprünglichen MARCM System zu überwinden ¹¹ ( 2A – 2C). Im tsMARCM System werden zwei RNA – Interferenz (RNAi) -basierte Suppressoren an trans-Stellen von homologen Chromosomen in einer Vorläuferzelle angeordnet sind, und die Expression dieser Suppressoren unabhängig die Expression ihrer jeweiligen Reporter (2B) hemmen. Im Anschluss an die ortsspezifische mitotische Rekombination vermittelt durch das FLP / FRT-System, das two RNAi-basierte Suppressoren getrennt werden in zwei Einzelzellen , die Expression von verschiedenen Reportern (2B) zu ermöglichen. Zwei klonalen Muster, single-Zelle , die mit Single-Zell – Klonen und zwei-cell-GMC zugeordnet mehrzelligen-NB – Klone, werden typischerweise in einem tsMARCM experiment (2C) zu sehen. Information von einer Seite der Doppelzellen abgeleitet sind, können als die Referenz für die andere Seite verwendet werden, wodurch hochauflösende neuralen lineage wie Geburten Datieren des markierten Neuronen Analysen und phänotypische Analyse von identischen Neuronen in verschiedenen Tieren, die für die genaue Untersuchung neuronaler Genfunktion ^{11, 12.} Hier präsentieren wir eine Schritt- für -Schritt – Protokoll beschreibt , wie ein tsMARCM Experiment durchzuführen, die von anderen Laboratorien verwendet werden , können ihr Studium der neuronalen Entwicklung (sowie die Entwicklung von anderen Geweben, wo zutreffend) in Drosophila zu erweitern.