Summary

ツインスポットMARCMを使用して細胞系譜の解析と遺伝子機能研究

Published: March 02, 2017
doi:

Summary

ここで、我々は、2つの異なる色で共通の前駆細胞由来の神経細胞の可視化を可能にモザイク標識技術のためのプロトコルを提示します。これは、出生付き合っ個々のニューロンを、異なる個体の同じ神経細胞に遺伝子機能を研究する能力を持つ神経系統解析を容易にします。

Abstract

Mは、r epressible Cのエルのメートルの arker(MARCM)でnalysisをosaic広く複雑な形態を描写する、そうでなければマークされていないと非摂動内のニューロンのサブセットにおける遺伝子の機能を操作するために、ショウジョウバエの神経生物学の研究に適用されている正のモザイク標識システムです生物。 MARCMシステムで生成された遺伝的モザイクは、有糸分裂中にマーク(MARCMクローン)とマークされていない娘細胞の両方を生成する前駆細胞を分割内の相同染色体間の部位特異的組換えを介して媒介されます。ツインスポットMARCM(tsMARCM)と呼ばれるMARCM法の拡張は、2つの異なる色で共通の前駆細胞由来ツイン細胞の両方にラベルを付けます。この技術は、両方の半系統から有用な情報の検索を可能にするために開発されました。総合tsMARCMクローンの異なるペアを分析することによって、tsMARCMシステムは、高解像度の神経系統マッピンを可能Gは共通の前駆細胞から産生される標識されたニューロンの正確な出生順序を明らかにする。また、tsMARCMシステムは、異なる動物の同一ニューロンの表現型分析を可能にすることにより、遺伝子機能研究を拡張します。ここでは、 ショウジョウバエの神経発達の研究を促進するためにtsMARCMシステムを適用する方法を説明します。

Introduction

ニューロンの膨大な数と多様な種類からなる脳は、プロセスを知覚し、外界からのチャレンジに応答する能力を有する動物を付与します。成体ショウジョウバエ中央脳のニューロンは開発1,2中、神経芽細胞(NBS)と呼ばれる神経幹細胞の限られた数から導出されます。 ショウジョウバエでは、脳の神経新生に関与するのNBのほとんどは、(ニューロン3に分化する2つの娘細胞を生成するために部門の別のラウンドを通過した後、自己再生のNBと神経節母細胞(GMCS)、およびGMCSを生成するために、非対称分裂を起こし、図1A )。そのため神経形態の複雑さや特定のニューロンを識別するに伴う課題の、正のモザイクラベリング技術、抑制性細胞マーカー(MARCM)とのモザイク解析は、visualizatを有効にするために発明されました単一ニューロンまたは周囲の、非標識ニューロン4の人口のうち、ニューロンの小さなサブセットのイオン。

MARCMはフリッパーゼ(FLP)の発現通常レポーター遺伝子4の発現を阻害するリプレッサー遺伝子のヘテロ接合性対立遺伝子を保有する分割前駆細胞内で相同染色体間の部位特異的組換えを媒介する/ FLP認識標的(FRT)システムを利用します。有糸分裂後、組換え染色体が1つのセルはリプレッサー遺伝子のホモ接合対立遺伝子を含まず、他のセルは全く抑制遺伝子-そのセル内のレポーターの発現(とその子孫)はもはやいないように、ツインセルに分離されています4を遮断しました 。三つのクローンのパターンFLPが確率的のNBまたはGMCSに誘導されるとき、通常MARCM実験で発見さ:単細胞resolutioで神経形態を示している単一セルおよび2セル-GMCクローン、nと、共通のNB( 図1B)由来のニューロンの全体の形態学的なパターンを明らかに多細胞-NBクローン、。 MARCM技術が広く脳全体の配線ネットワークを再構成するための神経細胞タイプ識別を含め、 ショウジョウバエ神経生物学の研究に適用されている、神経系統は、ニューロン、細胞運命の仕様に関与する遺伝子の機能の表現型の特徴の発達史を開示するための分析、および神経細胞の形態形成分化研究5、6、7、8、9、10。従来MARCMのみ誘発される有糸分裂組換え事象の後に2つの娘細胞(および系統)のいずれかをラベルするので、マークされていない側からの潜在的に有用な情報が失われます。この制限は、基本的なMの適用を排除します高解像度にARCMシステムは、高速テンポで細胞の運命を切り替える多くの神経系統の解析や精度に異なる動物11、12の同一の神経細胞に遺伝子機能の解析します。

ツインスポットMARCM(tsMARCM)が(そのため、元のMARCMシステム11の限界を克服し、ツインセルの両側から有用な情報の回復を可能にする二つの異なる色で共通の前駆細胞に由来する神経細胞を標識する高度なシステムであり、 図2A2C)。 tsMARCMシステムでは、2つのRNA干渉(RNAi)は、抑制が前駆細胞中の相同染色体のトランスサイトに位置しているベース、及びそれらの抑制の発現は、独立して、それぞれのレポーター( 図2B)の発現を阻害します。 FLP / FRT系を介して媒介部位特異的な有糸分裂組換えに続いて、TWなっOのRNAiベースの抑制は、異なるレポーター( 図2B)の発現を可能にするために、ツインセルに分離しました。二つのクローンのパターンは、多細胞-NBクローンに関連付けられた単一細胞クローン及び2セル-GMCに関連付けられた単一細胞は、典型的にtsMARCM実験( 図2C)に見られます。情報は、出生付き合っラベルされたニューロンなどの神経系統解析高解像度を可能にする、他の側面のための基準として利用することができるツインセルの一方の側に由来し、そして表現型は、正確な調査のために別の動物で同じニューロンの解析します神経遺伝子機能11、12。ここで、我々は(該当する場合だけでなく、他の組織の開発)、ショウジョウバエにおける神経発達の学業を広げるために、他の研究室で使用することができますtsMARCM実験を、実施方法を説明したステップバイステップのプロトコルを提示します。

Protocol

1.必要なトランスジーン11、13を使用してtsMARCM対応ハエを構築個々のハエ11によって運ばれた導入遺伝子からtsMARCM対応ハエの元のバージョンを生成します( 表1参照)。同じフライ株式13で複数の導入遺伝子を置くことによって、以前に記載されている標準的なフライ遺伝的交叉スキームを実?…

Representative Results

tsMARCMシステムは、共通のNBから誘導された神経細胞の重要な情報を検索することによって、神経系統解析および遺伝子機能の研究を容易にするために使用されてきました。このシステムは、神経細胞の種類(すべてではない)、ほとんどの識別各神経型の細胞数を決定し、にtsMARCMを使用してこれらのニューロンの出生順序<sup class="x…

Discussion

プロトコル内の重要なステップ

1.1.1、1.2.1、2.3、2.5、および3.2は良いtsMARCM結果を得るために重要であるステップ。神経前駆細胞にGAL4を発現していない組織特異的-GAL4ドライバはステップ1.1.1および1.2.1のために好ましいです。ステップ2.3で、フライ食品のバイアル中で増殖させた動物を過剰混雑は避けてください。誘導待ち時間、熱ショック時にFLPの発現レベル、お?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、科学技術省(MOST 104から2311-B-001から034)と、セルラおよび有機体生物学研究所、中央研究院、台湾によってサポートされていました。

Materials

Carbon dioxide (CO2) Local vendor n.a. Anesthetize flies
CO2 pad Local vendor n.a. Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4 Uniregion Bio-Tech (or other vendors) PBS001 Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549 Fix fly brains
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat Jackson ImmunoResearch  005-000-121 Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody Invitrogen MCD0800 Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody Clonetech 632496 Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Invitrogen A11006 Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546 Invitrogen A11035 Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent Molecular Probes S36936 Mount fly brains and protect quenching of fluorescence 
PYREX 9 depression glass spot plate Corning 7220-85 Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit World Precision Instruments SYLG184 Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal Sigma-Aldrich 242276-250G Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-30 Dissect and mount fly brains
Micro slide Corning 2948-75×25 Mount fly brains
Micro cover glass No.1.5 VWR International 48366-205 Mount fly brains
Nail polish Local vendor not available Seal micro cover glass on micro slides
Incubator  Kansin Instruments LTI603 culture flies at 25°C
(or other vendors)
Water bath Kansin Instruments WB212-B2 Induce heat-shock in flies at 37°C
(or other vendors)
Orbital shaker Kansin Instruments OS701 Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope Leica EZ4 Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope Zeiss (or other vendors) LSM 700 (or other models) Image tsMARCM clones
image-processing software 1
(e.g., Zeiss LSM image browser) 
Zeiss not available Project stacks of confocal images
image-processing software 2
(e.g., Image-J) 
not available not available Count cell number of tsMARCM clones

Referências

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Citar este artigo
Shen, H., Hsu, T., Chung, P., Yu, H. Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM. J. Vis. Exp. (121), e55278, doi:10.3791/55278 (2017).

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