Este vídeo mostra experimentos com posterior análise de interações proteína-proteína através da utilização de micro-padrão superfícies. A abordagem oferece a possibilidade de detectar as interações de proteínas em células vivas e combina alta capacidade de processamento com a possibilidade de extrair informações quantitativas.
Desvendar a rede de interação de moléculas<em> In-vivo</em> É a chave para a compreensão dos mecanismos que regulam a função celular e metabolismo. Uma multidão de opções metodológicas para tratar as interações moleculares nas células têm sido desenvolvidas, mas a maioria destes métodos sofrem de ser bastante indireta e, portanto, dificilmente quantitativa. Pelo contrário, alguns high-end abordagens quantitativas foram introduzidas, que no entanto são difíceis de estender a alta taxa de transferência. Para combinar as capacidades de alto rendimento com a possibilidade de extrair informações quantitativas, que recentemente desenvolveu um novo conceito para a identificação de interações proteína-proteína (Schwarzenbacher<em> Et al</em>., 2008). Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a concepção e construção deste sistema que permite analisar as interações entre um fluoróforo marcado com proteína ("presa") e uma proteína de membrana ("isca")<em> In-vivo</em>. Células são semeadas em superfícies micropatterned funcionalizados com anticorpos contra o domínio isca exoplasmic. Isca presa interações são analisadas através da redistribuição da presa fluorescente. O método é caracterizado pela alta sensibilidade para o nível de moléculas individuais, a capacidade de detectar interações fracas, e capacidade de produção elevada, tornando-o aplicável como ferramenta de triagem.
O vídeo que acompanha demonstra um método para a detecção de interações proteína-proteína na membrana plasmática de células vivas (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in press). Em princípio, qualquer plataforma de microscopia TIRF baseada pode ser usado como sistema de leitura. Somente quando de alta sensibilidade é desejada (por exemplo, para a detecção de moléculas simples), microscópios avançados serão necessários. Para alcançar melhores resultados os seguintes pontos críticos durante o processo de preparação requerem uma atenção especial:
A técnica de micro-padronização oferece diversas possibilidades para a análise das interações proteína-proteína. Em primeiro lugar, juntamente com a quantificação do local, espacialmente resolvidos interações proteína-proteína também a detecção de interações fracas ou indirecta é possível sem a desvantagem de dar um elevado número de falsos positivos ou negativos. Em segundo lugar, permite ao pesquisador analisar interações proteína-proteína na membrana plasmática de células vivas, que é difícil de conseguir por abordagens bioquímicas como a tela de 2 híbridos. Em terceiro lugar a abordagem permite a detecção de isca presa interações que são modulados por mudanças ambientais, como a temperatura, a presença de diferentes proteínas ou outras moléculas ou modificações pós-translacionais. Assim, o ensaio permite a moduladores de triagem de um par de interação dada no contexto de células vivas. Além disso, ao reduzir a densidade de superfície do ligante captura ou o uso de ligantes monovalentes, a análise do estado de repouso se torna possível. Finalmente, se adequado plataformas de digitalização são utilizados, o número de células analisadas é alta o suficiente para atender as demandas de alto rendimento das empresas farmacêuticas para a triagem de drogas (Ramm, 2005).
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer Quentina Beatty, da Universidade de Linz, na Áustria, por sua ajuda tipo, Katharina Strub, Universidade de Genebra, na Suíça, para a construção hCD71-GFP, e Legler Daniel, Universidade de Konstanz, na Suíça, para o GPI-GFP DAF-construir. Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Ciência Austríaco (FWF; projeto Y250-B03) eo projeto GEN-AU do Ministério Federal Austríaco da Ciência e Investigação.