In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon
Summary
Deze video laat zien experimenten met daarop volgende analyse van eiwit-eiwit interacties door het gebruik van micro-oppervlakken met een patroon. De aanpak biedt de mogelijkheid om eiwit interacties op te sporen in levende cellen en combineert een hoge doorvoer-mogelijkheden met de mogelijkheid te extraheren kwantitatieve informatie.
Abstract
Het ontrafelen van de interactie netwerk van moleculen<em> In-vivo</em> Is de sleutel tot het begrijpen van de mechanismen die celfunctie en metabolisme regelen. Een veelheid van methodologische opties voor het aanpakken van moleculaire interacties in cellen zijn ontwikkeld, maar de meeste van deze methoden lijden nogal indirect en daarom nauwelijks kwantitatief. Integendeel, een aantal high-end kwantitatieve benaderingen werden geïntroduceerd, die echter moeilijk uit te breiden tot high throughput. Te combineren hoge doorvoersnelheid mogelijkheden met de mogelijkheid om kwantitatieve informatie halen, hebben we onlangs een nieuw concept ontwikkeld voor het identificeren van eiwit-eiwit interacties (Schwarzenbacher<em> Et al.</em>., 2008). We beschrijven hier een gedetailleerd protocol voor het ontwerp en de bouw van dit systeem die het mogelijk maakt voor het analyseren van interacties tussen een fluorofoor-gelabeld eiwit ("prooi") en een membraan eiwit ("lokaas")<em> In-vivo</em>. Cellen worden uitgeplaat op micropatterned oppervlakken gefunctionaliseerd met antilichamen tegen de aas exoplasmic domein. Bait-prooi interacties getest via de herverdeling van de fluorescerende prooi. De methode wordt gekenmerkt door een hoge gevoeligheid tot op het niveau van afzonderlijke moleculen, de mogelijkheid om zwakke interacties te detecteren, en hoge doorvoer capaciteit, waardoor het van toepassing screening tool.
Protocol
Discussion
De bijhorende video toont een methode voor het detecteren van eiwit-eiwit interacties in de plasma-membraan van levende cellen (Schwarzenbacher et al., 2008;. Brameshuber et al., 2009;.. Weghuber et al., in press). In principe kan elk TIRF-gebaseerde microscopie platform worden gebruikt als uitlezen systeem. Alleen wanneer een hoge gevoeligheid is gewenst (bijvoorbeeld voor het opsporen van enkele moleculen), zullen geavanceerde microscopen nodig zijn. Om dit te bereiken de beste resultaten de volgende kritieke punten tijdens de voorbereiding vereisen speciale aandacht:
- Store Cy5-stock-oplossing onder donkere omstandigheden om te voorkomen dat bleken van de fluorofoor en vers bereiden van de BSA-Cy5 werken oplossing voor de microcontact afdrukken.
- Let erop dat u de micropattern kras op de PDMS met de pipetpunt en het monster onder donkere omstandigheden om te voorkomen dat bleken van de fluorofoor incuberen.
- Doe de dekglaasje op een steriel gaasje om plakken te voorkomen van het glaasje aan de petrischaal. Zodra de PDMS stempel heeft gehandeld op grond van het glas glijden, niet verplaatsen.
- Voorkomen dat luchtbellen in de reactie kamer en incubeer het monster onder donkere omstandigheden om te voorkomen dat bleken van de fluorofoor.
- Niet laten de steekproef drogen meer dan 2 minuten om de vorming van zoutkristallen te voorkomen.
- Voor het losmaken van de cellen geen gebruik maken van trypsine omdat het klieven het extracellulaire domein van tot nu toe tot uitdrukking membraaneiwitten. Het vermijden van trypsine zal nuttig zijn voor eiwitten met een lage omloopsnelheid te micropatterns formulier direct na bevestiging van de cellen op het oppervlak.
- Controle het aantal ingelegde cellen in een microscoop en zorg ervoor dat cellen niet meer dan 30-50% confluentie bereiken. Zorg ervoor dat excessieve cellen direct worden verwijderd als gevolg van de snelle bevestiging van cellen op het antilichaam-gecoate oppervlak.
- Alleen dia's met een hoge kwaliteit BSA-Cy5 patronen kan worden gebruikt voor verdere analyse.
- Stabiele expressie van het fluorescerende eiwit prooi heeft de voorkeur te wijten aan een groter aantal cellen dat kan worden geanalyseerd per scan.
- Adequate TIRF aanpassing is noodzakelijk om patronen te wijten aan cytosolische achtergrond te visualiseren.
De micro-patronen techniek biedt verschillende mogelijkheden voor de analyse van eiwit-eiwit interacties. Ten eerste, samen met de kwantificering van de lokale, ruimtelijk opgelost eiwit-eiwit interacties ook het opsporen van zwakke of indirecte interacties mogelijk is zonder het nadeel van het geven van een groot aantal valse positieven of negatieven. Ten tweede stelt de onderzoeker om eiwit-eiwit interacties te analyseren in de plasma-membraan van levende cellen, die moeilijk te bereiken is door biochemische methoden, zoals de twee-hybride scherm. Ten derde is de aanpak maakt het mogelijk voor de detectie van aas-prooi interacties die worden gemoduleerd door veranderingen in het milieu, zoals de temperatuur, de aanwezigheid van verschillende eiwitten of andere moleculen of post-translationele modificaties. Dus de test maakt voor de screening modulatoren van een bepaalde interactie paar in de context van levende cellen. Bovendien, door het verminderen van de oppervlakte dichtheid van de vangst ligand of het gebruik van monovalente liganden, de analyse van de toestand van rust wordt het mogelijk te maken. Tot slot, als er voldoende scanplatformen worden gebruikt, het aantal geanalyseerde cellen hoog genoeg is om high throughput eisen van de farmaceutische bedrijven voor drug discovery (Ramm, 2005) match.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Quentina Beatty, Universiteit van Linz, Oostenrijk, bedanken voor haar vriendelijke hulp, Katharina Strub, Universiteit van Genève, Zwitserland, voor de hCD71-GFP te bouwen, en Daniel Legler, Universiteit van Konstanz, Zwitserland, voor het GPI-GFP DAF-construct. Dit werk werd ondersteund door de Oostenrijkse Science Fonds (FWF, project Y250-B03) en het GEN-AU-project van het Oostenrijkse ministerie van Wetenschap en Onderzoek.
Referências
- Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. Reply to “Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments. Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).
- Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8. Science. 301, 1725-1728 (2003).
- Ramm, P. Image-based screening: a technology in transition. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).
- Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells. Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).
- Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning. Methods in Enzymology. , .
