In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen
Summary
Dieses Video zeigt Experimente mit anschließender Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch den Einsatz von Mikro-gemusterten Oberflächen. Der Ansatz bietet die Möglichkeit, Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu erkennen und verbindet hohe Durchsatz mit der Möglichkeit, quantitative Informationen zu extrahieren.
Abstract
Die Aufklärung der Interaktion Netzwerk von Molekülen<em> In-vivo</em> Ist der Schlüssel zum Verständnis der Mechanismen, die die Zellfunktion und den Stoffwechsel regulieren. Eine Vielzahl von methodischen Möglichkeiten für die Behandlung molekularer Wechselwirkungen in Zellen entwickelt worden, aber die meisten dieser Methoden leiden darunter, eher indirekt und daher kaum quantitativ. Im Gegenteil, ein paar High-End-quantitative Ansätze wurden eingeführt, die jedoch schwer zu hohen Durchsatz zu verlängern. So kombinieren hohe Durchsatz mit der Möglichkeit, quantitative Informationen zu extrahieren, haben wir kürzlich ein neues Konzept entwickelt für die Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen (Schwarzenbacher<em> Et al</em>., 2008). Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Konzeption und den Bau dieses Systems, die für die Analyse von Interaktionen zwischen einem Fluorophor-markierten Protein ("Beute") und ein Membranprotein ermöglicht ("Köder")<em> In-vivo</em>. Die Zellen werden auf mikrostrukturierten Oberflächen mit Antikörpern gegen den Köder exoplasmic Domain-funktionalisierte überzogen. Bait-Beute-Interaktionen sind über die Neuverteilung der fluoreszierenden Beute untersucht. Das Verfahren ist durch eine hohe Empfindlichkeit bis auf die Ebene einzelner Moleküle, die Fähigkeit, schwache Wechselwirkungen zu erkennen und mit hohem Durchsatz Fähigkeit charakterisiert, so dass es für die Screening-Instrument.
Protocol
Discussion
Das dazugehörige Video zeigt ein Verfahren zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Plasmamembran von lebenden Zellen (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in press). Im Prinzip kann jeder TIRF-basierte Mikroskopie-Plattform als Anzeige verwendet werden. Nur wenn eine hohe Empfindlichkeit gewünscht wird (zB für die Detektion einzelner Moleküle), werden fortgeschrittene Mikroskope verlangt werden. Um dies zu erreichen beste Ergebnisse die folgenden kritischen Punkte während des Herstellungsprozesses erfordern besondere Aufmerksamkeit:
- Shop Cy5-Stammlösung bei schlechten Lichtverhältnissen zu vermeiden Bleichen des Fluorophors und bereiten die BSA-Cy5 Arbeit Lösung frisch vor dem Mikrokontaktdrucken.
- Achten Sie darauf, nicht auf die Mikrostruktur auf dem PDMS Kratzer mit der Pipettenspitze und inkubieren Sie die Probe bei schlechten Lichtverhältnissen zu vermeiden Bleichen des Fluorophors.
- Legen Sie das Deckglas auf einem sterilen Tupfer zu verhindern Verkleben der Glasscheibe auf die Petrischale. Sobald die PDMS-Stempel auf den Objektträger geklebt hat, bewegen Sie es nicht.
- Vermeiden Sie Luftblasen in der Reaktionskammer und inkubieren Sie die Probe bei schlechten Lichtverhältnissen zu vermeiden Bleichen des Fluorophors.
- Lassen Sie sich nicht die Probe trocken für mehr als 2 Minuten, um die Bildung von Salzkristallen zu vermeiden.
- Für die Ablösung der Zellen nicht verwenden Trypsin als es Abspaltung der extrazellulären Domäne des bisher geäußert Membranproteinen. Vermeiden Trypsin wird hilfreich sein, die für Proteine mit niedrigen Fluktuationsrate zu Mikrostrukturen unmittelbar nach Anheftung der Zellen auf der Oberfläche bilden.
- Kontrollieren Sie die Anzahl der inkubierten Zellen im Mikroskop und stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht erreichen mehr als 30-50% Konfluenz. Stellen Sie sicher, dass die übermäßige Zellen sofort sind auf die schnelle Befestigung von Zellen auf der Antikörper-beschichteten Oberfläche entfernt.
- Nur Folien mit hoher Qualität BSA-Cy5 Muster können zur weiteren Analyse verwendet werden.
- Stabile Expression des fluoreszierenden Proteins Beute ist vorzuziehen aufgrund der größeren Anzahl von Zellen, die pro Scan analysiert werden kann.
- Angemessene TIRF Einstellung ist unerlässlich, um Muster durch cytosolische Hintergrund sichtbar zu machen.
Die Mikro-Strukturierung Technik bietet mehrere Möglichkeiten für die Analyse von Protein-Protein-Interaktionen. Erstens, zusammen mit der Quantifizierung der lokalen, räumlich aufgelöster Protein-Protein-Interaktionen auch die Detektion von schwachen oder indirekten Wechselwirkungen ist, ohne den Nachteil, dass eine hohe Anzahl von falschen Positiven oder Negativen möglich. Zweitens ermöglicht die Forscher, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Plasmamembran von lebenden Zellen, die nur schwer durch biochemische Ansätze wie die 2-Hybrid-Screen zu erreichen, ist zu analysieren. Drittens der Ansatz ermöglicht die Erkennung von Köder-Beute-Interaktionen, moduliert durch Veränderungen der Umwelt wie die Temperatur, die Anwesenheit verschiedener Proteine oder andere Moleküle oder post-translationale Modifikationen sind. So ist die Assay ermöglicht die Screening-Modulatoren einer bestimmten Interaktion Paar im Kontext der lebenden Zellen. Darüber hinaus, indem die Flächendichte der Erfassung Liganden oder die Verwendung von monovalenten Liganden, wird die Analyse der Ruhezustand möglich. Schließlich, wenn ausreichende Scan-Plattformen verwendet werden, ist die Zahl der analysierten Zellen hoch genug, um einen hohen Durchsatz Anforderungen der Pharma-Unternehmen für Wirkstoff-Screening (Ramm, 2005) überein.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Quentina Beatty, Universität Linz, Österreich, für ihre freundliche Hilfe, Katharina Strub, Universität Genf, Schweiz danken, für die hCD71-GFP-Konstrukt, und Daniel Legler, Universität Konstanz, der Schweiz, für die GPI-GFP -DAF zu konstruieren. Und die GEN-AU Projekt des österreichischen Bundesministeriums für Wissenschaft und Forschung; Diese Arbeit wurde vom FWF (Projekt Y250-B03 FWF) unterstützt.
Referências
- Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. Reply to “Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments. Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).
- Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8. Science. 301, 1725-1728 (2003).
- Ramm, P. Image-based screening: a technology in transition. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).
- Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells. Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).
- Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning. Methods in Enzymology. , .
