En vivo-La detección de interacciones proteína-proteína en la Micro-patrón superficies

Microcontacto de impresión: Recorta el campo de micropattern del sello PDMS con un bisturí Lave el campo que contiene el micropattern por lavado con etanol (100%) y agua destilada. Seque el sello PDMS con nitrógeno o argón. Añadir 50 l de BSA-Cy5 solución de trabajo (0,67 mg / ml) en el sello PDMS, para que todo el campo micropattern está cubierto con la solución. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Lavar el campo micropattern lavándolo con tampón fosfato salino (PBS) y agua destilada. Seque el PDMS con nitrógeno o argón. Coloque el sello PDMS por su propio peso en medio de un revestimiento epóxico cubreobjetos y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente en una placa de Petri. Etiqueta de la posición de la marca de PDMS en la parte trasera del cubreobjetos y tira el sello de la diapositiva con una pinza. Palo de una cámara de sello de hibridación seguro sobre el campo microcontacto impresos en el cubreobjetos. La etiqueta ayuda a localizar el centro del campo. Pipeta de 60 estreptavidina l solución de trabajo (50 mg / ml) en la cámara de reacción e incubar la muestra durante 60 minutos a temperatura ambiente. Lavar la muestra con 1 ml de PBS mediante la adición de la memoria intermedia en un puerto de la cámara y eliminarlo de forma simultánea en el segundo puerto con una bomba. Pipeta de 60 l de anticuerpos con biotina solución de trabajo (10 mg / ml en PBS suplementado con 0,1% de Tween 20; "PBST") en la cámara de reacción e incubar durante 60 min a temperatura ambiente. Lavar la muestra con 1 ml de PBST y luego 1 ml de PBS mediante la adición de la memoria intermedia en un puerto de la cámara y la eliminación de nuevo en el segundo puerto con una bomba. Tienda de las superficies micropatterned en PBS en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que las células están listas para la siembra. La incubación de las células en la superficie micropatterned: Crecen las células adherentes al 50% de confluencia en una placa de cultivo de 3 cm de tejido. Separar las células que expresan proteínas cebo y la presa de intereses con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se centrifuga 5 min a 1.000 rpm. Eliminar el sobrenadante y disolver el pellet de células en el medio de cultivo de acuerdo. Centrifugar 5 min a 1.000 rpm. Eliminar el sobrenadante y disolver el pellet de células en medio de cultivo apropiado. Intercambio de la PBS de la cámara de reacción en el cubreobjetos micropatterned en un 60 l de la suspensión celular. Crear una cámara húmeda empapando una gasa estéril con agua destilada y ponerlo en la placa de Petri para evitar que la muestra de la falta de agua. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C en un 5% de CO2 la atmósfera en la superficie micropatterned. Antes de analizar las células en el microscopio, el medio de intercambio por solución salina tamponada Hank s como Ca 2 + y Mg 2 +. Microscopía: El cubreobjetos se coloca sobre un soporte adecuado y la morfología de las células se examinan bajo luz blanca. La calidad de los BSA-Cy5 patrones está marcada por la excitación a 647 nm. Micropatrones de presa de proteínas fluorescentes (GFP o YFP) se registran en 488 o 514 nm en reflexión interna total (TIR) ​​de excitación. Los resultados representativos: Si hay una interacción entre las proteínas diana en las células cultivadas en una superficie micropatterned, la presa seguirá la redistribución de cebo. El micropattern resultante puede ser visualizado por la etiqueta de fluorescencia de la proteína de la presa. Es importante destacar el contraste obtenido proporciona una medida directa de la fuerza de interacción (ver Figura 1). Por lo tanto, una simple evaluación de la interacción de dos proteínas es posible – sin necesidad de otro proceso de los datos primarios medidos. Figura 1. Reordenamiento del cebo en la membrana de células plasmáticas en vivo en diferentes fuerzas de interacción. TIR imágenes de las células transfectadas con T24 (a) CD71-GFP en CD71-anticuerpo, CD4 (b) y YFP citosólica de CD4-anticuerpo y (c) GPI-DAF-GFP en microbiochips CD59-anticuerpo se muestran. Los datos son característicos de una fuerte (a), no (b) o de la interacción débil (c). (A) se reproduce a partir de (Weghuber et al., En prensa), (b) de (Schwarzenbacher et al., 2008).