In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

Microcontact הדפסה: לגזור שדה micropattern של הבול PDMS באמצעות אזמל לשטוף את השדה המכיל את micropattern על ידי שטיפה זה עם אתנול (100%) ומים מזוקקים. יבש חותמת PDMS עם חנקן או גז ארגון. פיפטה 50 μl-BSA Cy5 פתרון עבודה (0.67 מ"ג / מ"ל) על הבול PDMS כך שהשדה כולו micropattern מכוסה פתרון. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את השדה micropattern על ידי שטיפה עם בופר פוספט (PBS) ומים מזוקקים. יבש PDMS עם חנקן או גז ארגון. מניחים את החותמת PDMS תחת כובד משקלו על גבי באמצע coverslip אפוקסי מצופה אחד דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בצלחת פטרי. לייבל את המיקום של החותמת PDMS על הישבן של coverslip לבין הרצועה החותמת משקופית עם מלקחיים. Stick Secure חותם הכלאה קאמרית מעל שדה microcontact מודפס על coverslip. התווית עוזר למקם את מרכז השדה. פיפטה 60 streptavidin μl עבודה פתרון (50 מיקרוגרם / מ"ל) לתוך תא התגובה דגירה המדגם עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את המדגם עם 1 מ"ל PBS על ידי הוספת מאגר ליציאת אחד של החדר ואת הסרתו בו זמנית בנמל השני עם משאבה. פיפטה 60 עובדים μl biotinylated פתרון נוגדן (10 מיקרוגרם / מ"ל ​​PBS בתוספת 0.1% Tween 20: "PBST") לתוך תא התגובה דגירה של 60 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את המדגם עם 1 מ"ל PBST ולאחר מכן 1 מ"ל PBS על ידי הוספת מאגר ליציאת אחד של החדר והסרת אותו שוב בנמל השני עם משאבה. חנות משטחי micropatterned ב PBS בחושך בטמפרטורת החדר עד תאים מוכנים זריעה. דגירה של תאים על פני השטח micropatterned: לגדל תאים חסיד אל מפגש 50% צלחת 3 רקמות ס"מ תרבות. ניתוק התאים לבטא הפיתיון טרף חלבונים עניין עם פתרון Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) חומצה צנטריפוגות 5 דקות ב 1000 סל"ד. בטל supernatant ו לפזר את התא גלולה במדיום הגידול פי. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 סל"ד. בטל supernatant ו לפזר את התא גלולה במדיום הגידול המתאים. הבורסה PBS מהאולם תגובה על ידי coverslip micropatterned μl 60 השעיה של התא. יצירת תא humidified על ידי השריית משטח סטרילי במים מזוקקים ומכניסים אותו לתוך צלחת פטרי כדי למנוע מדגם ריצה יבשה. דגירה התאים על פני הלילה בשעה 37 ° C באווירה 5% CO 2 על משטחים micropatterned. לפני ניתוח תאים במיקרוסקופ, חילופי בינוני שנאגרו על ידי פתרון של האנק מלח כולל Ca 2 + ו – Mg 2 +. מיקרוסקופית: Coverslip ממוקם על הר מתאימים את המורפולוגיה התא נבדק תחת אור לבן. האיכות של ה-BSA Cy5 דפוסי נבדק על ידי עירור ב 647 ננומטר. Micropatterns של חלבון פלואורסצנטי טרף (GFP או YFP) נרשמות 488 או 514 ננומטר תחת סך עירור פנימית השתקפות (TIR). נציג התוצאות: אם יש אינטראקציה בין חלבונים בתאים היעד גדל על משטח micropatterned, הטרף יעברו חלוקה מחדש הפיתיון. Micropattern וכתוצאה מכך ניתן דמיינו לפי תווית של חלבון פלואורסצנטי את הטרף. חשוב לציין את הניגוד המתקבל מספק מדידה ישירה של כוח האינטראקציה (ראה איור 1). לכן הערכה פשוטה של ​​אינטראקציה של שני חלבונים הופך אפשרי – ללא צורך להמשיך ולעבד את הנתונים העיקריים שנמדדו. באיור 1. סידור מחדש של הפיתיון בתוך קרום התא פלזמה לחיות בעוצמות אינטראקציה שונה. תמונות TIR של תאים T24 transfected עם (א) CD71-GFP על נוגדן CD71, (ב) ו – CD4 YFP cytosolic על נוגדנים CD4 ו – (ג) GPI-GFP-DAF-CD59 על נוגדן microbiochips מוצגים. נתונים אופייניים עבור חזקה (א), לא (ב) או אינטראקציה חלשה (ג). (א) מובא מן (Weghuber et al., In press), (ב) מ – (Schwarzenbacher et al. 2008).