微图案的表面上的蛋白质-蛋白质相互作用的体内检测

微接触印刷： 切出的微型图象领域的PDMS邮票使用手术刀用乙醇（100％）和蒸馏水冲洗，洗净的字段，其中包含的微型图象。 干燥氮气或氩气的PDMS邮票。 移液器50μL牛血清白蛋白- Cy5的工作解决方案，使整个微型图象领域的解决方案覆盖到PDMS印花税（0.67毫克/毫升）。孵育30分钟在室温。 缓冲液（PBS）和蒸馏水洗净，用磷酸盐冲洗微型图象领域。 干燥氮气或氩气的PDMS。 根据其自身的重量放置到一个环氧涂层的盖玻片中的PDMS邮票和孵育30分钟室温在培养皿。 盖玻片的背面标签上的PDMS邮票的位置，并从幻灯片用钳的邮票地带。 坚持在盖玻片上的微接触印刷领域的一个安全的密封杂交腔。标签帮助本地化领域的中心。 移液器60μL链霉亲和工作的解决方案（50微克/毫升），进入反应室和孵化样品在室温下60分钟。 用1 ml PBS清洗样品，加入到一室的端口的缓冲区，并在用泵的第二个端口同时删除。 移液器60μL生物素化抗体工作液（10微克/毫升与0.1％吐温20的PBS补充“; PBST”）进入反应室，并在室温下60分钟的孵育。 加入到一室的端口的缓冲区，并再次清除它与泵的第二个端口，用1 ml PBST和随后1毫升PBS清洗样品。 在室温避光储存在PBS的micropatterned表面，直至细胞播种准备。 孵化到micropatterned表面的细胞： 贴壁细胞生长至50％在3厘米的组织培养板汇合。 分离细胞表达利益诱饵和猎物的蛋白质与乙二胺四乙酸（EDTA）的解决方案，并在1000转离心5分钟。 弃上清，并根据生长介质中的溶解细胞沉淀。 在1000转离心5分钟。 弃上清，并在适当的培养液溶解细胞沉淀。 交易所从60μL的细胞悬液micropatterned盖玻片上的反应室的PBS。 浸泡在蒸馏水中的无菌垫，放入培养皿中干燥运行，以防止样品创建一个湿盒。 过夜的细胞在37 °彗星在5％的CO 2 micropatterned表面的气氛。 分析细胞在显微镜前，中期交换汉克小号缓冲输入盐溶液， 包括CA 2 +，Mg 2 +的。 显微镜： 盖玻片放置在一个合适的贴装和检查细胞形态下的白光。 在647 nm处激发的牛血清白蛋白- Cy5的模式的质量检查。 记录在488或514 nm的全内反射（TIR）激发下的荧光猎物蛋白（GFP或YFP）的微图案。 代表性的成果： 如果有在上micropatterned表面细胞生长的靶蛋白之间的相互作用，猎物将按照诱饵再分配。微型图象可以被可视化的猎物蛋白的荧光标记。重要的是取得的对比提供了一个直接的措施，相互作用的强度（见图1）。因此，两种蛋白质的相互作用的简单评价成为可能 – 没有必要进一步处理测得的原始数据。 图1。饵料在活细胞质膜在不同的互动优势的重排。 TIR图像（一）CD71 – GFP转染T24细胞上的CD71抗体，（B）的CD4和CD4抗体胞浆YFP和CD59抗体microbiochips（C）的GPI – GFP – DAF所示。数据特征为强（A），无（b）或弱相互作用（C）。 （一）转载（Weghuber 等 ，出版中），（二）（Schwarzenbacher 等 ，2008）。