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Utilizzo In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer per studiare la dinamica dei complessi della proteina ad una scala di tempo di millisecondo
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JoVE 신문 생화학
Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale
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Utilizzo In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer per studiare la dinamica dei complessi della proteina ad una scala di tempo di millisecondo

DOI:
10.3791/59038-v

•

10:50 min

•

March 14, 2019

•

, ,
1Department of Biochemistry,Purdue University, 2Department of Botany and Plant Pathology,Purdue University, 3Center for Plant Biology,Purdue University

Chapters

  • 00:04Title
  • 00:33Designing the FRET Assay
  • 01:12Preparation of Cul1AMC•Rbx1, the FRET Donor Protein
  • 04:42Preparation of FlAsHCand1, the FRET Acceptor Protein
  • 05:18Testing and Confirmation of the FRET Assay
  • 06:08Measuring the Association Rate Constant
  • 07:37Measuring the Dissociation Rate Constant of Cul1•Cand1 in the Presence of Skp•F-box Protein
  • 08:33Results: Dynamics Of Protein Complexes
  • 10:30Conclusion

Summary

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Interazioni proteina-proteina sono critiche per sistemi biologici, e studi di cinetica di legame forniscono intuizioni la dinamica e la funzione dei complessi della proteina. Descriviamo un metodo che quantifica i parametri cinetici di una proteina complessa che utilizza il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza e la tecnica di flusso interrotto.

Tags

FRETProtein ComplexKineticsAssociationDissociationCOL1CAND17-amino-4-methylcoumarinFlASHCell LysisSonicationCentrifugationGlutathione BeadsElutionThrombinBuffer A

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