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In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren
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JoVE 신문 생화학
Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale
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In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

DOI:
10.3791/59038-v

•

10:50 min

•

March 14, 2019

•

, ,
1Department of Biochemistry,Purdue University, 2Department of Botany and Plant Pathology,Purdue University, 3Center for Plant Biology,Purdue University

Chapters

  • 00:04Title
  • 00:33Designing the FRET Assay
  • 01:12Preparation of Cul1AMC•Rbx1, the FRET Donor Protein
  • 04:42Preparation of FlAsHCand1, the FRET Acceptor Protein
  • 05:18Testing and Confirmation of the FRET Assay
  • 06:08Measuring the Association Rate Constant
  • 07:37Measuring the Dissociation Rate Constant of Cul1•Cand1 in the Presence of Skp•F-box Protein
  • 08:33Results: Dynamics Of Protein Complexes
  • 10:30Conclusion

Summary

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Protein-Protein-Interaktionen sind von entscheidender Bedeutung für biologische Systeme, und Studien der verbindliche Kinetik geben Einblicke in die Dynamik und Funktion von Proteinkomplexen. Wir beschreiben eine Methode, die die kinetischen Parameter von einem Proteinkomplex mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer und die gestoppt-Flow-Technik quantifiziert.

Tags

FRETProtein ComplexKineticsAssociationDissociationCOL1CAND17-amino-4-methylcoumarinFlASHCell LysisSonicationCentrifugationGlutathione BeadsElutionThrombinBuffer A

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