κ-Carrageenan Sub-Microjel Ortamı Kullanılarak Doku Benzeri Yapıların Gömülü Biyobaskısı
Summary
Bu çalışma, dikkate değer geri dönüşümlü sıkışma-sıkışma giderme geçiş özellikleri sergileyen yeni bir κ-İrlanda yosunu alt mikrojel süspansiyon banyosunu tanıtmaktadır. Bu özellikler, gömülü 3D biyobaskıda biyomimetik doku ve organların inşasına katkıda bulunur. Kalp/özofagus benzeri dokuların yüksek çözünürlüklü ve hücre büyümesi ile başarılı bir şekilde basılması, yüksek kaliteli biyobaskı ve doku mühendisliği uygulamalarını göstermektedir.
Abstract
Granül hidrojel destek banyosu kullanan gömülü üç boyutlu (3D) biyobaskı, biyomimetik iskeleler oluşturmak için kritik bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, hassas biyomürekkep birikimini hücre canlılığı ve işlevi ile dengeleyen uygun bir jel süspansiyon ortamının mühendisliği, özellikle istenen viskoelastik özelliklerin elde edilmesinde birçok zorluk ortaya çıkarmaktadır. Burada, yeni bir κ-karagenan jel destek banyosu, homojen alt mikro ölçekli parçacıklar üreten, kullanımı kolay bir mekanik öğütme işlemiyle üretilir. Bu alt mikrojeller, biyomürekkeplerin düzgün bir şekilde birikmesini kolaylaştıran küçük akma gerilimi ve hızlı kesme inceltme özellikleri ile tipik Bingham akış davranışı sergiler. Ayrıca, κ-karagenan mikrojel ağının geri dönüşümlü jel-sol geçişi ve kendi kendini iyileştirme yetenekleri, basılı yapıların yapısal bütünlüğünü sağlayarak, tanımlanmış mimari özelliklere sahip karmaşık, çok katmanlı doku yapılarının oluşturulmasını sağlar. Baskı sonrası, κ-karagenan alt mikrojelleri, basit bir fosfat tamponlu tuzlu su yıkama ile kolayca çıkarılabilir. Hücre yüklü biyomürekkeplerle daha fazla biyobaskı, biyomimetik yapılar içindeki hücrelerin %92 gibi yüksek bir canlılığa sahip olduğunu ve psödopodiyi hızla uzattığını ve ayrıca sağlam proliferasyonu sürdürdüğünü göstermektedir, bu da doku ve organ üretimi için bu biyo-baskı stratejisinin potansiyelini göstermektedir. Özetle, bu yeni κ-İrlanda yosunu alt mikrojel ortamı, mühendislik doku ve organlarının in vitro gelişimi için derin etkiler taşıyan, olağanüstü kalitede gömülü biyo-baskı için umut verici bir yol olarak ortaya çıkmaktadır.
Introduction
Elektro-eğrilmiş lifler, gözenekli süngerler ve polimer hidrojeller dahil olmak üzere doku mühendisliği iskeleleri, hücre büyümesini, doku yenilenmesini ve organ fonksiyonunun restorasyonunu destekleyen yapısal bir çerçeve sağlayarak hasarlı doku ve organların onarımında ve yeniden yapılandırılmasında çok önemli bir rol oynar 1,2,3. Bununla birlikte, geleneksel iskeleler, doğal doku yapılarını doğru bir şekilde kopyalamada zorluklarla karşılaşır ve bu da tasarlanmış ve doğal dokular arasında bir uyumsuzluğa yol açar. Bu sınırlama, kusurlu dokuların verimli bir şekilde iyileşmesini engelleyerek, daha doğru biyomimikri elde etmek için iskele tasarımı ilerlemelerine acil ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır. Üç boyutlu (3D) biyobaskı, biyomalzeme mürekkepleri ve hücreleri kullanarak karmaşık biyolojik doku yapılarını katman katman hassas bir şekilde oluşturan yenilikçi bir üretim tekniğidir4. Çeşitli biyomalzemeler arasında, polimer hidrojeller, hücrelerin yerinde kapsüllenmesini kolaylaştıran ve büyümelerini en önemli şekilde destekleyen ayırt edici ağları ile ideal biyomürekkepler olarak ortaya çıkmaktadır 5,6. Bununla birlikte, birçok yumuşak ve yüksek oranda hidratlı hidrojel, biyomürekkep olarak kullanıldığında, baskı işlemi sırasında basılı iskele yapılarının bulanıklaşmasına veya hızlı bir şekilde çökmesine neden olma eğilimindedir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, gömülü 3D biyo-baskı teknolojisi, destek malzemesi olarak bir mikrojel banyosu kullanır ve hassas yumuşak biyomürekkep biriktirmeye izin verir. Hidrojel biyomürekkeplerin jelleşmesi üzerine, mikrojel banyosu çıkarılarak karmaşık yapılara sahip rafine biyonik iskeleler elde edilir. Jelatin 7,8, agaroz9 ve gellan zamkı10,11 gibi malzemeler, gömülü 3D biyobaskı için mikrojel banyoları oluşturmak için kullanılmış ve doku mühendisliğinde yumuşak hidrojellerin uygulanmasını önemli ölçüde ilerletmiştir. Bununla birlikte, bu parçacıklı jellerin mikron düzeyinde ve tekdüze olmayan parçacık boyutu, 3D baskınınçözünürlüğünü ve aslına uygunluğunu zararlı bir şekilde etkiler 12,13,14. Küçük ve homojen bir şekilde dağılmış parçacıklara sahip jel benzeri bir süspansiyon şamandırasının üretilmesine acil ihtiyaç vardır ve bu da yüksek kaliteli biyo-baskı elde etmede avantajlar sunar.
Bu protokolde, gömülü 3D baskı için tek tip bir mikron altı seviyesine sahip yeni bir kurban granül κ-İrlanda yosunu süspansiyon banyosu sunulmaktadır. Hızlı sıkışma-sıkışma giderme geçişinin bu yenilikçi alt mikrojel banyosu davranışı, yüksek yapısal doğruluğa sahip biyomimetik hidrojel iskelelerin hassas imalatını kolaylaştırır15. Bu yeni süspansiyon ortamını kullanarak, jelatin metakrilat ve ipek fibro metakrilattan oluşan kompozit bir biyomürekkep kullanılarak çok katmanlı doku yapılarına sahip bir dizi biyomimetik doku ve organ yapısı başarıyla basılmıştır. Bu çalışmada, özofagusun sadece çok katmanlı bir doku yapısına sahip olması değil, aynı zamanda kas tabakasının iç, dairesel ve dış, uzunlamasına karmaşık bir katmanlama yapısı sergilemesi nedeniyle, 3D biyo-baskı biyomimetik nesnesi olarak özofagusu seçtik. Bu katmanların uygun şekilde hizalanmasını ve organizasyonunu sağlamak, fonksiyonel doku rejenerasyonu için esastır. Bu nedenle, yemek borusunun çok katmanlı mimarisini çoğaltmayı çok arzuluyoruz. Daha da önemlisi, doku mühendisliği için biyomimetik bir iskele tasarlamak ve inşa etmek için süspansiyon banyosu olarak κ-karragenan alt mikrojelleri ve biyomürekkep olarak GelMA/SFMA’yı kullandık. Basılı yemek borusu, tekrarlanan fosfat tamponlu tuzlu su yıkama ile kolayca serbest bırakılabilir. Ayrıca, κ-karragenan alt mikrojel banyosu sitotoksik maddeler içermez ve yüksek sitouyumluluk sağlar15. Anizotropik iskeleler içine yüklenen düz kas hücreleri, kayda değer bir yayılma aktivitesi sergiler. Bu tek tip alt mikrojel süspansiyon ortamı, gömülü 3D biyo-baskı yoluyla karmaşık doku ve organların üretimi için yeni bir yol sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biyobaskıda kullanılmak üzere κ-karagenan alt mikrojel süspansiyon banyolarının hazırlanması, elde edilen ortamın biyomürekkepleri desteklemek için istenen özellikleri sergilemesini sağlamak için birkaç kritik adımı içeren, dikkatlice düzenlenmiş bir süreçtir. İlk olarak, κ-İrlanda yosunu tozunun yüksek sıcaklıklarda deiyonize su içinde çözülmesi ve homojen bir karışım oluşturulmasıyla bir κ-karagenan çözeltisi hazırlan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Ningbo Doğa Bilimleri Vakfı (2022J121, 2023J159), Ningbo Şehri Doğa Bilimleri Vakfı’nın Anahtar projesi (2021J256), Polimerlerin Moleküler Mühendisliği Devlet Anahtar Laboratuvarı Açık Vakfı (Fudan Üniversitesi) (K2024-35) ve Çin’in Zhejiang Eyaleti Aterosklerotik Hastalıklar için Hassas Tıp Anahtar Laboratuvarı (2022E10026) tarafından desteklenmiştir. Ningbo Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Çekirdek Tesisleri’nin teknik desteği için teşekkür ederiz.
Materials
| 3D bioprinter | Custom-designed | ||
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole | Solarbio Life Science | C0065 | Ready-to-use |
| 405 nm UV light | EFL | XY-WJ01 | |
| Cell Counter | Corning | Cyto smart 6749 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | STELLARIS 5 | |
| DMEM high glucose | VivaCell | C3113-0500 | High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine |
| Dynamic rotational rheometer | TA Instrument | Discovery HR-20 | |
| Esophageal smooth muscle cells | Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University | Primary cells from the rabbit esophagus | |
| Fetal bovine serum | UE | F9070L | |
| Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin | Solarbio Life Science | CA1610 | 300T |
| Gelatin methacrylate | EFL | EFL-GM-60 | 60% substitution |
| k-carrageenan | Aladdin | C121013-100g | Reagent grade |
| Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate | Aladdin | L157759-1g | 365~405 nm |
| Live-Dead kit | beyotime | C2015M | |
| Microplate reader | Potenov | PT-3502B | |
| Paraformaldehyde | Solarbio Life Science | P1110 | 4% |
| Penicillin/streptomycin | Solarbio Life Science | MA0110 | 100 ´ |
| Phosphate buffered saline | VivaCell | C3580-0500 | pH 7.2-7.4 |
| Silk fibroin methacrylate | EFL | EFL-SilMA-001 | 39% substitution |
| Triton X-100 | Solarbio Life Science | T8200 | |
| Trypsin-EDTA | VivaCell | C100C1 | 0.25%, without phenol red |
References
- Xu, X., et al. Biodegradable engineered fiber scaffolds fabricated by electrospinning for periodontal tissue regeneration. J Biomater Appl. 36 (1), 55-75 (2021).
- Amann, E., et al. A graded, porous composite of natural biopolymers and octacalcium phosphate guides osteochondral differentiation of stem cells. Adv Healthcare Mater. 10 (6), e2001692 (2021).
- Afjoul, H., et al. Freeze-gelled alginate/gelatin scaffolds for wound healing applications: An in vitro, in vivo study. Mater Sci Eng C. 113, 110957 (2020).
- Hasanzadeh, R., et al. Biocompatible tissue-engineered scaffold polymers for 3D printing and its application for 4D printing. Chem Eng J. 476, 146616 (2023).
- Fu, L., et al. Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement. Nature. 618 (7966), 740-747 (2023).
- Bertsch, P., et al. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758 (2015).
- Wang, S., et al. 3d bioprinting of neurovascular tissue modeling with collagen-based low-viscosity composites. Adv Healthcare Mater. 12 (25), e2300004 (2023).
- Sreepadmanabh, M., et al. Jammed microgel growth medium prepared by flash-solidification of agarose for 3d cell culture and 3d bioprinting. Biomed Mater. 18 (4), 045011 (2023).
- Zeng, J., et al. Comparative analysis of the residues of granular support bath materials on printed structures in embedded extrusion printing. Biofabrication. 15 (3), 035013 (2023).
- Terpstra, M. L., et al. Bioink with cartilage-derived extracellular matrix microfibers enables spatial control of vascular capillary formation in bioprinted constructs. Biofabrication. 14 (3), 034104 (2022).
- Compaan, A. M., et al. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Appl Mater Inter. 11 (6), 5714-5726 (2019).
- Compaan, A. M., Song, K., Chai, W., Huang, Y. Cross-linkable microgel composite matrix bath for embedded bioprinting of perfusable tissue constructs and sculpting of solid objects. ACS Appl Mater Inter. 12 (7), 7855-7868 (2020).
- Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910573 (2020).
- Zhang, H., et al. Cation-crosslinked κ-carrageenan sub-microgel medium for high-quality embedded bioprinting. Biofabrication. 16, 025009 (2024).
- Lee, A., et al. 3d bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- Yao, J., et al. Slightly photo-crosslinked chitosan/silk fibroin hydrogel adhesives with hemostasis and anti-inflammation for pro-healing cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. Mater Today Bio. 25, 100947 (2024).
- Senior, J. J., et al. Agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting. J Vis Exp. (195), e64458 (2023).
- Roche, C. D., et al. Printability, durability, contractility and vascular network formation in 3d bioprinted cardiac endothelial cells using alginate-gelatin hydrogels. Front Bioeng Biotech. 9, 636257 (2021).
- Wang, D., et al. Microfluidic bioprinting of tough hydrogel-based vascular conduits for functional blood vessels. Sci Adv. 8 (43), eabq6900 (2022).
- Shao, L., Hou, R. X., Zhu, Y. B., Yao, Y. D. Pre-shear bioprinting of highly oriented porous hydrogel microfibers to construct anisotropic tissues. Biomater Sci. 9 (20), 6763-6771 (2021).
.