In dieser Studie wird ein neuartiges κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbad vorgestellt, das bemerkenswerte reversible Jamming-Unjamming-Übergangseigenschaften aufweist. Diese Attribute tragen zur Konstruktion biomimetischer Gewebe und Organe im eingebetteten 3D-Bioprinting bei. Das erfolgreiche Drucken von herz-/ösophagusähnlichem Gewebe mit hoher Auflösung und Zellwachstum demonstriert hochwertige Bioprinting- und Tissue-Engineering-Anwendungen.
Der eingebettete dreidimensionale (3D) Biodruck unter Verwendung eines körnigen Hydrogel-Stützbades hat sich als wichtige Technik für die Erstellung biomimetischer Gerüste erwiesen. Die Entwicklung eines geeigneten Gelsuspensionsmediums, das die präzise Abscheidung von Biotinte mit der Lebensfähigkeit und Funktion der Zellen in Einklang bringt, stellt jedoch mehrere Herausforderungen dar, insbesondere bei der Erzielung der gewünschten viskoelastischen Eigenschaften. Hier wird ein neuartiges κ-Carrageen-Gel-Stützbad durch einen einfach zu bedienenden mechanischen Mahlprozess hergestellt, wodurch homogene submikroskalige Partikel hergestellt werden. Diese Submikrogele weisen ein typisches Bingham-Fließverhalten mit geringer Fließspannung und schnellen Scherverdünnungseigenschaften auf, die eine reibungslose Abscheidung von Biotinten ermöglichen. Darüber hinaus gewährleisten der reversible Gel-Sol-Übergang und die Selbstheilungskräfte des κ-Carrageen-Mikrogel-Netzwerks die strukturelle Integrität der gedruckten Konstrukte und ermöglichen die Schaffung komplexer, mehrschichtiger Gewebestrukturen mit definierten architektonischen Merkmalen. Nach dem Druck können die κ-Carrageen-Submikrogele leicht durch eine einfache phosphatgepufferte Kochsalzlösung entfernt werden. Weiteres Bioprinting mit zellbeladenen Biotinten zeigt, dass Zellen innerhalb der biomimetischen Konstrukte eine hohe Lebensfähigkeit von 92% aufweisen und Pseudopodien schnell vermehren sowie eine robuste Proliferation beibehalten, was auf das Potenzial dieser Bioprinting-Strategie für die Gewebe- und Organherstellung hinweist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses neuartige κ-Carrageen-Submikrogel-Medium einen vielversprechenden Weg für eingebettetes Bioprinting von außergewöhnlicher Qualität darstellt und tiefgreifende Auswirkungen auf die In-vitro-Entwicklung von gentechnisch hergestellten Geweben und Organen hat.
Tissue-Engineering-Gerüste, einschließlich elektrogesponnener Fasern, poröser Schwämme und Polymer-Hydrogele, spielen eine zentrale Rolle bei der Reparatur und Rekonstruktion geschädigter Gewebe und Organe, indem sie ein strukturelles Gerüst bieten, das das Zellwachstum, die Geweberegeneration und die Wiederherstellung der Organfunktion unterstützt 1,2,3. Herkömmliche Gerüste stoßen jedoch auf Herausforderungen bei der genauen Nachbildung nativer Gewebestrukturen, was zu einer Diskrepanz zwischen dem technischen und dem natürlichen Gewebe führt. Diese Einschränkung behindert die effiziente Heilung von defektem Gewebe und unterstreicht die dringende Notwendigkeit von Fortschritten beim Gerüstdesign, um eine genauere Biomimikry zu erreichen. Dreidimensionales (3D) Bioprinting ist eine innovative Herstellungstechnik, die komplexe biologische Gewebestrukturen Schicht für Schicht mit Hilfe von Biomaterialtinten und -zellen präzise konstruiert4. Unter den verschiedenen Biomaterialien erweisen sich Polymer-Hydrogele mit ihrem unverwechselbaren Netzwerk, das die In-situ-Verkapselung von Zellen erleichtert und ihr Wachstum entscheidend unterstützt, als ideale Biotinten 5,6. Nichtsdestotrotz neigen viele weiche und hochhydratisierte Hydrogele dazu, während des Druckprozesses eine Unschärfe oder einen schnellen Zusammenbruch der gedruckten Gerüststrukturen zu induzieren, wenn sie als Biotinten verwendet werden. Um diese Herausforderung zu meistern, verwendet die eingebettete 3D-Bioprinting-Technologie ein Mikrogelbad als Stützmaterial, das eine präzise Abscheidung von weicher Biotinte ermöglicht. Nach der Gelierung der Hydrogel-Biotinten werden durch Entfernen des Mikrogelbads veredelte bionische Gerüste mit komplizierten Strukturen erhalten. Materialien wie Gelatine 7,8, Agarose9 und Gellangummi10,11 wurden verwendet, um Mikrogelbäder für den eingebetteten 3D-Biodruck herzustellen und die Anwendung von weichen Hydrogelen im Tissue Engineering erheblich voranzutreiben. Die mikrometergenaue und ungleichmäßige Partikelgröße dieser Partikelgele wirkt sich jedoch nachteilig auf die Auflösung und Wiedergabetreue des 3D-Drucksaus 12,13,14. Es besteht ein dringender Bedarf, einen gelartigen Suspensionsschwimmer mit kleinen und gleichmäßig dispergierten Partikeln herzustellen, der Vorteile bei der Erzielung von High-Fidelity-Bioprinting bietet.
In diesem Protokoll wird ein neuartiges Opfergranulat-κ-Carrageen-Suspensionsbad mit einem einheitlichen Submikron-Gehalt für den eingebetteten 3D-Druck vorgestellt. Dieses innovative Submikrogel-Badverhalten des schnellen Jamming-Unjamming-Übergangs ermöglicht die präzise Herstellung von biomimetischen Hydrogel-Gerüsten mit hoher Strukturtreue15. Unter Verwendung dieses neuen Suspensionsmediums wird eine Reihe von biomimetischen Gewebe- und Organkonstrukten mit mehrschichtigen Gewebestrukturen erfolgreich gedruckt, wobei eine Komposit-Biotinte aus Gelatinemethacrylat und Seidenfibromethacrylat verwendet wird. In dieser Studie haben wir die Speiseröhre als biomimetisches 3D-Bioprinting-Objekt ausgewählt, vor allem weil die Speiseröhre nicht nur eine mehrschichtige Gewebestruktur aufweist, sondern auch ihre Muskelschicht eine innere kreisförmige und eine äußere longitudinale komplexe Schichtstruktur aufweist. Die Sicherstellung der richtigen Ausrichtung und Organisation dieser Schichten ist für die Regeneration des funktionellen Gewebes unerlässlich. Daher ist es uns ein großes Anliegen, die vielschichtige Architektur der Speiseröhre nachzubilden. Noch wichtiger ist, dass wir κ-Carrageen-Submikrogele als Suspensionsbad und GelMA/SFMA als Biotinte verwendeten, um ein biomimetisches Gerüst für das Tissue Engineering zu entwerfen und zu konstruieren. Die gedruckte Speiseröhre kann durch wiederholtes Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung leicht gelöst werden. Darüber hinaus ist das κ-Carrageen-Submikrogelbad frei von zytotoxischen Substanzen, was eine hohe Zytokompatibilität gewährleistet15. Die glatten Muskelzellen, die in anisotropen Gerüsten geladen sind, zeigen eine bemerkenswerte Spreizaktivität. Dieses einheitliche Sub-Mikrogel-Suspensionsmedium bietet einen neuen Weg für die Herstellung komplexer Gewebe und Organe durch eingebetteten 3D-Biodruck.
Die Herstellung von κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbädern für den Einsatz im Bioprinting ist ein sorgfältig orchestrierter Prozess, der mehrere kritische Schritte umfasst, um sicherzustellen, dass das resultierende Medium die gewünschten Eigenschaften zur Unterstützung von Biotinten aufweist. Zunächst wird eine κ-Carrageen-Lösung hergestellt, indem das κ-Carrageen-Pulver in deionisiertem Wasser bei erhöhten Temperaturen aufgelöst wird, wodurch eine homog…
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde unterstützt von der Ningbo Natural Science Foundation (2022J121, 2023J159), dem Schlüsselprojekt der Natural Science Foundation der Stadt Ningbo (2021J256), der Open Foundation des State Key Laboratory of Molecular Engineering of Polymers (Fudan University) (K2024-35) und dem Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases der Provinz Zhejiang, China (2022E10026). Vielen Dank für die technische Unterstützung durch die Core Facilities, Health Science Center der Universität Ningbo.
3D bioprinter | Custom-designed | ||
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole | Solarbio Life Science | C0065 | Ready-to-use |
405 nm UV light | EFL | XY-WJ01 | |
Cell Counter | Corning | Cyto smart 6749 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | STELLARIS 5 | |
DMEM high glucose | VivaCell | C3113-0500 | High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine |
Dynamic rotational rheometer | TA Instrument | Discovery HR-20 | |
Esophageal smooth muscle cells | Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University | Primary cells from the rabbit esophagus | |
Fetal bovine serum | UE | F9070L | |
Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin | Solarbio Life Science | CA1610 | 300T |
Gelatin methacrylate | EFL | EFL-GM-60 | 60% substitution |
k-carrageenan | Aladdin | C121013-100g | Reagent grade |
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate | Aladdin | L157759-1g | 365~405 nm |
Live-Dead kit | beyotime | C2015M | |
Microplate reader | Potenov | PT-3502B | |
Paraformaldehyde | Solarbio Life Science | P1110 | 4% |
Penicillin/streptomycin | Solarbio Life Science | MA0110 | 100 ´ |
Phosphate buffered saline | VivaCell | C3580-0500 | pH 7.2-7.4 |
Silk fibroin methacrylate | EFL | EFL-SilMA-001 | 39% substitution |
Triton X-100 | Solarbio Life Science | T8200 | |
Trypsin-EDTA | VivaCell | C100C1 | 0.25%, without phenol red |