本研究介绍了一种新型 κ-角叉菜胶亚微凝胶悬浮浴,显示出显着的可逆干扰-非干扰过渡特性。这些属性有助于在嵌入式 3D 生物打印中构建仿生组织和器官。成功打印具有高分辨率和细胞生长的心脏/食管样组织,展示了高质量的生物打印和组织工程应用。
利用颗粒水凝胶支撑浴的嵌入式三维 (3D) 生物打印已成为创建仿生支架的关键技术。然而,设计一种合适的凝胶悬浮培养基来平衡精确的生物墨水沉积与细胞活力和功能存在多重挑战,尤其是在实现所需的粘弹性方面。在这里,通过易于操作的机械研磨工艺制造了一种新型 κ-角叉菜胶凝胶支撑浴,产生均匀的亚微米级颗粒。这些亚微凝胶表现出典型的 Bingham 流动行为,具有较小的屈服应力和快速剪切稀化特性,有助于生物墨水的顺利沉积。此外, κ-卡拉胶微凝胶网络的可逆凝胶-溶胶转变和自愈能力确保了打印结构的结构完整性,从而能够创建具有明确结构特征的复杂、多层组织结构。打印后, κ-角叉菜胶亚微凝胶可以通过简单的磷酸盐缓冲盐水洗涤轻松去除。使用载细胞生物墨水的进一步生物打印表明,仿生构建体内的细胞具有 92% 的高活力,可快速扩展伪足,并保持稳健的增殖,表明这种生物打印策略在组织和器官制造方面的潜力。总之,这种新型 κ-角叉菜胶亚微凝胶培养基成为一种有前途的高质量嵌入式生物打印途径,对工程组织和器官的 体外 发育具有深远的影响。
组织工程支架,包括静电纺丝纤维、多孔海绵和聚合物水凝胶,通过提供支持细胞生长、组织再生和器官功能恢复的结构框架,在受损组织和器官的修复和重建中发挥关键作用 1,2,3.然而,传统支架在准确复制天然组织结构方面遇到了挑战,导致工程组织和天然组织不匹配。这种限制阻碍了缺陷组织的有效愈合,强调了支架设计进步以实现更准确的仿生学的迫切需求。三维 (3D) 生物打印是一种创新的制造技术,它使用生物材料墨水和细胞逐层精确构建复杂的生物组织结构4。在各种生物材料中,聚合物水凝胶成为理想的生物墨水,其独特的网络有助于细胞的原位封装,并关键地支持其生长 5,6。然而,当用作生物墨水时,许多柔软且高度水合的水凝胶在打印过程中往往会诱导打印的支架结构模糊或快速塌陷。为了应对这一挑战,嵌入式 3D 生物打印技术采用微凝胶浴作为支撑材料,可实现精确的软生物墨水沉积。水凝胶生物墨水凝胶化后,通过去除微凝胶浴获得具有复杂结构的精制仿生支架。明胶 7,8、琼脂糖9 和结冷胶10,11 等材料已被用于制造用于嵌入式 3D 生物打印的微凝胶浴,显着推动了软水凝胶在组织工程中的应用。然而,这些颗粒凝胶的微米级和不均匀粒径会对 3D 打印的分辨率和保真度产生不利影响 12,13,14。迫切需要制造一种具有小而均匀分散颗粒的凝胶状悬浮浮子,为实现高保真生物打印提供优势。
在该协议中,提出了一种具有均匀亚微米级的新型牺牲颗粒 κ-卡拉胶悬浮浴,用于嵌入式 3D 打印。这种快速干扰-去干扰过渡的创新亚微凝胶浴行为有助于精确制造具有高结构保真度的仿生水凝胶支架15。利用这种新的悬浮培养基,采用由甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸丝纤维组成的复合生物墨水,成功打印了一系列具有多层组织结构的仿生组织和器官构建体。在这项研究中,我们选择食管作为 3D 生物打印仿生对象,主要是因为食管不仅具有多层组织结构,而且其肌肉层表现出内部圆形和外部纵向复杂的分层结构。确保这些层的正确对齐和组织对于功能性组织再生至关重要。因此,我们非常希望复制食道的多层结构。更重要的是,我们利用 κ-角叉菜胶亚微凝胶作为悬浮浴,使用 GelMA/SFMA 作为生物墨水来设计和构建用于组织工程的仿生支架。打印的食管可以通过反复磷酸盐缓冲盐水清洗轻松释放。此外, κ-角叉菜胶亚微凝胶浴不含细胞毒性物质,可确保高细胞相容性15。加载在各向异性支架内的平滑肌细胞表现出显着的扩散活性。这种均匀的亚微凝胶悬浮培养基为通过嵌入式 3D 生物打印制造复杂组织和器官提供了一条新途径。
用于生物打印的 κ–角叉菜胶亚微凝胶悬浮浴的制备是一个精心策划的过程,涉及几个关键步骤,以确保所得培养基表现出支持生物墨水所需的特性。最初,通过将 κ–卡拉胶粉末在高温下溶解在去离子水中,形成均匀的混合物来制备 κ–卡拉胶溶液。溶液的浓度是关键,必须针对后续的凝胶化进行优化。0.3-0.6% (wt/vol) κ-</stron…
The authors have nothing to disclose.
本研究由宁波市自然科学基金(2022J121、2023J159)、宁波市自然科学基金重点项目(2021J256)、复旦大学高分子工程国家重点实验室开放基金(K2024-35)和浙江省动脉粥样硬化疾病精准医学重点实验室(2022E10026)资助。感谢宁波大学健康科学中心核心设施的技术支持。
3D bioprinter | Custom-designed | ||
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole | Solarbio Life Science | C0065 | Ready-to-use |
405 nm UV light | EFL | XY-WJ01 | |
Cell Counter | Corning | Cyto smart 6749 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | STELLARIS 5 | |
DMEM high glucose | VivaCell | C3113-0500 | High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine |
Dynamic rotational rheometer | TA Instrument | Discovery HR-20 | |
Esophageal smooth muscle cells | Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University | Primary cells from the rabbit esophagus | |
Fetal bovine serum | UE | F9070L | |
Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin | Solarbio Life Science | CA1610 | 300T |
Gelatin methacrylate | EFL | EFL-GM-60 | 60% substitution |
k-carrageenan | Aladdin | C121013-100g | Reagent grade |
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate | Aladdin | L157759-1g | 365~405 nm |
Live-Dead kit | beyotime | C2015M | |
Microplate reader | Potenov | PT-3502B | |
Paraformaldehyde | Solarbio Life Science | P1110 | 4% |
Penicillin/streptomycin | Solarbio Life Science | MA0110 | 100 ´ |
Phosphate buffered saline | VivaCell | C3580-0500 | pH 7.2-7.4 |
Silk fibroin methacrylate | EFL | EFL-SilMA-001 | 39% substitution |
Triton X-100 | Solarbio Life Science | T8200 | |
Trypsin-EDTA | VivaCell | C100C1 | 0.25%, without phenol red |
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