Aplicación de grafeno monocapa a rejillas de criomicroscopía electrónica para la determinación de estructuras de alta resolución

La microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (crioEM) se ha convertido en un método ampliamente utilizado para visualizar^{macromoléculas} biológicas. Impulsado por los avances en la detección directa de electrones ^2,3,4, la adquisición de datos⁵ y los algoritmos de procesamiento de imágenes ^6,7,8,9,10, cryoEM es ahora capaz de producir estructuras 3D de resolución casi atómica de un número cada vez mayor de macromoléculas¹¹. Además, al aprovechar la naturaleza de una sola molécula del enfoque, los usuarios pueden determinar múltiples estructuras a partir de una sola muestra 12,13,14,15, lo que destaca la promesa de utilizar los datos generados para comprender conjuntos estructurales heterogéneos ^16,17. A pesar de estos avances, persisten los cuellos de botella en la preparación de la rejilla de muestras criogénicas.

Para la caracterización estructural por crioEM, las muestras biológicas deben estar bien dispersas en solución acuosa y luego deben ser congeladas rápidamente a través de un proceso llamado vitrificación^18,19. El objetivo es capturar partículas en una capa uniformemente delgada de hielo vitrificado suspendida a través de agujeros espaciados regularmente que generalmente se cortan en una capa de carbono amorfo. Esta lámina de carbono amorfa estampada está soportada por una rejilla TEM que soporta una malla de barras de soporte de cobre u oro. En los flujos de trabajo estándar, las rejillas se vuelven hidrófilas mediante un tratamiento de plasma de descarga incandescente antes de la aplicación de la muestra. El exceso de líquido se seca con papel de filtro, lo que permite que la solución proteica forme una fina película líquida a través de los orificios que se puede vitrificar fácilmente durante la congelación por inmersión. Los desafíos comunes incluyen la localización de partículas en la interfaz aire-agua (AWI) y la posterior desnaturalización^20,21,22 o la adopción de orientaciones preferidas 23,24,25, la adherencia de las partículas a la lámina de carbono en lugar de migrar hacia los agujeros, y la agrupación y agregación de las partículas dentro de los agujeros ²⁶. El espesor no uniforme del hielo es otra preocupación; El hielo grueso puede dar lugar a niveles más altos de ruido de fondo en las micrografías debido al aumento de la dispersión de electrones, mientras que el hielo extremadamente delgado puede excluir partículas más grandes²⁷.

Para abordar estos desafíos, se ha utilizado una variedad de películas de soporte delgadas para recubrir las superficies de la rejilla, lo que permite que las partículas descansen sobre estos soportes e, idealmente, eviten las interacciones con la interfaz aire-agua. Los soportes de grafeno han demostrado ser muy prometedores, en parte debido a su alta resistencia mecánica junto con su mínima sección transversal de dispersión, que reduce la señal de fondo añadida por la capa^{de soporte 28}. Además de su mínima contribución al ruido de fondo, el grafeno también exhibe una notable conductividad eléctrica y térmica²⁹. Se ha demostrado que las rejillas recubiertas de grafeno y óxido de grafeno producen una mayor densidad de partículas, una distribución más uniforme de las partículas³⁰ y una localización reducida en el AWI²². Además, el grafeno proporciona una superficie de soporte que se puede modificar aún más para: 1) ajustar las propiedades fisicoquímicas de la superficie de la rejilla a través de la funcionalización 31,32,33; o 2) acoplar agentes enlazantes que faciliten la purificación por afinidad de proteínas de interés 34,35,36.

En este artículo, hemos modificado un procedimiento existente para recubrir rejillas crioEM con una sola capa uniforme de grafeno³⁰. Las modificaciones tienen como objetivo minimizar el manejo de la red en todo el protocolo, con el objetivo de aumentar el rendimiento y la reproducibilidad. Además, discutimos nuestro enfoque para evaluar la eficacia de varios tratamientos UV/ozono en la representación de rejillas hidrófilas antes de la inmersión. Este paso en la preparación de muestras crioEM utilizando rejillas recubiertas de grafeno es fundamental, y hemos encontrado que nuestro método sencillo para cuantificar la hidrofilicidad relativa de las rejillas resultantes es útil. Utilizando este protocolo, demostramos la utilidad de emplear rejillas recubiertas de grafeno para la determinación de la estructura mediante la generación de una reconstrucción 3D de alta resolución de S. pyogenes Cas9 catalíticamente inactivo en complejo con ARN guía y ADN diana.