Anwendung von Monolayer-Graphen auf Kryo-Elektronenmikroskopie-Gitter zur hochauflösenden Strukturbestimmung

Die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) hat sich zu einer weit verbreiteten Methode zur Visualisierung biologischer Makromoleküle entwickelt¹. Angetrieben von Fortschritten bei der direkten Elektronendetektion ^2,3,4, der Datenerfassung⁵ und den Bildverarbeitungsalgorithmen ^6,7,8,9,10 ist die KryoEM nun in der Lage, 3D-Strukturen mit nahezu atomarer Auflösung einer schnell wachsenden Anzahl von Makromolekülen^{zu erzeugen 11}. Darüber hinaus können Benutzer durch die Nutzung der Einzelmolekülnatur des Ansatzes mehrere Strukturen aus einer einzigen Probe 12,13,14,15 bestimmen, was das Versprechen unterstreicht, die generierten Daten zum Verständnis heterogener Strukturensembles ^16,17 zu verwenden. Trotz dieser Fortschritte gibt es nach wie vor Engpässe bei der Gittervorbereitung von Kryoproben.

Für die strukturelle Charakterisierung mittels KryoEM sollten biologische Proben gut in wässriger Lösung dispergiert und dann durch einen Prozess namens Vitrifikation^18,19 schockgefroren werden. Das Ziel ist es, Partikel in einer gleichmäßig dünnen Schicht aus verglastem Eis einzufangen, die über regelmäßig verteilte Löcher hängt, die normalerweise in eine Schicht aus amorphem Kohlenstoff geschnitten sind. Diese gemusterte amorphe Kohlenstofffolie wird von einem TEM-Gitter getragen, das ein Netz aus Kupfer- oder Goldstützstäben trägt. In Standardarbeitsabläufen werden die Gitter vor dem Auftragen der Probe durch eine Glimmentladungsplasmabehandlung hydrophil gemacht. Überschüssige Flüssigkeit wird mit Filterpapier abgetupft, so dass die Proteinlösung einen dünnen Flüssigkeitsfilm über die Löcher bilden kann, der beim Eintauchen leicht vitrifiziert werden kann. Zu den allgemeinen Herausforderungen gehören die Lokalisierung von Partikeln an der Luft-Wasser-Grenzfläche (AWI) und die anschließende Denaturierung ^20,21,22 oder die Annahme bevorzugter Orientierungen 23,24,25, die Anhaftung der Partikel an der Kohlenstofffolie, anstatt in die Löcher zu wandern, sowie die Clusterbildung und Aggregation der Partikel innerhalb der Löcher²⁶. Eine ungleichmäßige Eisdicke ist ein weiteres Problem. Dickes Eis kann aufgrund erhöhter Elektronenstreuung zu einem höheren Hintergrundrauschen in den Schliffbildern führen, während extrem dünnes Eis größere Partikel ausschließen kann²⁷.

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, wurde eine Vielzahl dünner Trägerfilme verwendet, um Gitteroberflächen zu beschichten, so dass Partikel auf diesen Trägern ruhen können und im Idealfall Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche vermieden werden. Graphenträger haben sich als sehr vielversprechend erwiesen, zum Teil aufgrund ihrer hohen mechanischen Festigkeit in Verbindung mit ihrem minimalen Streuquerschnitt, der das von der Trägerschicht²⁸ hinzugefügte Hintergrundsignal reduziert. Neben seinem minimalen Beitrag zum Hintergrundrauschen weist Graphen auch eine bemerkenswerte elektrische und thermische Leitfähigkeit^{auf 29}. Es hat sich gezeigt, dass mit Graphen und Graphenoxid beschichtete Gitter eine höhere Partikeldichte, eine gleichmäßigere Partikelverteilung³⁰ und eine geringere Lokalisierung zum AWI²² aufweisen. Darüber hinaus bietet Graphen eine Trägeroberfläche, die weiter modifiziert werden kann, um: 1) die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Gitteroberfläche durch Funktionalisierung^{31, 32, 33} abzustimmen; oder 2) Kopplungsverbindungsmittel, die die Affinitätsreinigung von Proteinen von Interesse erleichtern 34,35,36.

In diesem Artikel haben wir ein bestehendes Verfahren zur Beschichtung von KryoEM-Gittern mit einer einzigen gleichmäßigen Schicht aus Graphen³⁰ modifiziert. Die Modifikationen zielen darauf ab, die Netzhandhabung im gesamten Protokoll zu minimieren, mit dem Ziel, die Ausbeute und Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Darüber hinaus diskutieren wir unseren Ansatz zur Bewertung der Wirksamkeit verschiedener UV/Ozon-Behandlungen, um Gitter vor dem Eintauchen hydrophil zu machen. Dieser Schritt bei der KryoEM-Probenvorbereitung mit graphenbeschichteten Gittern ist von entscheidender Bedeutung, und wir haben festgestellt, dass unsere einfache Methode zur Quantifizierung der relativen Hydrophilie der resultierenden Gitter nützlich ist. Mit diesem Protokoll demonstrieren wir den Nutzen der Verwendung von Graphen-beschichteten Gittern zur Strukturaufklärung, indem wir eine hochauflösende 3D-Rekonstruktion von katalytisch inaktivem S. pyogenes Cas9 im Komplex mit Guide-RNA und Ziel-DNA erstellen.