יישום גרפן חד-שכבתי ברשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה
Summary
היישום של שכבות תמיכה ברשתות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryoEM) יכול להגדיל את צפיפות החלקיקים, להגביל אינטראקציות עם ממשק אוויר-מים, להפחית תנועה הנגרמת על ידי אלומה, ולשפר את התפלגות כיווני החלקיקים. מאמר זה מתאר פרוטוקול חזק לציפוי רשתות cryoEM בשכבה אחת של גרפן לשיפור הכנת דגימת קריו.
Abstract
במיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryoEM), מקרומולקולות מטוהרות מיושמות על רשת הנושאת רדיד פחמן חור; לאחר מכן מכתימים את המולקולות כדי להסיר עודפי נוזל ומוקפאות במהירות בשכבה בעובי של 20-100 ננומטר של קרח זגוגית, המרחפים על פני חורי רדיד אלומיניום ברוחב של כ-1 מיקרומטר. הדגימה המתקבלת מצולמת באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני, ולאחר עיבוד תמונה באמצעות תוכנה מתאימה, ניתן לקבוע מבנים ברזולוציה כמעט אטומית. למרות האימוץ הנרחב של cryoEM, הכנת הדגימות נותרה צוואר בקבוק חמור בתהליכי העבודה של cryoEM, כאשר משתמשים נתקלים לעתים קרובות באתגרים הקשורים לדגימות המתנהגות בצורה גרועה בקרח הזגוגית המרחף. לאחרונה פותחו שיטות לשינוי רשתות cryoEM עם שכבה רציפה אחת של גרפן, הפועלת כמשטח תמיכה שלעתים קרובות מגדיל את צפיפות החלקיקים באזור המצולם ויכול להפחית אינטראקציות בין חלקיקים לבין ממשק אוויר-מים. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים ליישום גרפן לרשתות cryoEM ולהערכה מהירה של ההידרופיליות היחסית של הרשתות המתקבלות. בנוסף, אנו מתארים שיטה מבוססת EM כדי לאשר את נוכחותו של גרפן על ידי הדמיה של דפוס עקיפה אופייני שלה. לבסוף, אנו מדגימים את התועלת של תמיכות גרפן אלה על ידי שחזור מהיר של מפת צפיפות ברזולוציה של 2.7 Å של קומפלקס Cas9 באמצעות מדגם טהור בריכוז נמוך יחסית.
Introduction
מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני של חלקיק יחיד (cryoEM) התפתח לשיטה נפוצה להדמיית מקרומולקולות ביולוגיות1. מונע על ידי התקדמות בזיהוי אלקטרונים ישיר 2,3,4, רכישת נתונים5, ואלגוריתמים לעיבוד תמונה 6,7,8,9,10, cryoEM מסוגל כעת לייצר מבנים תלת-ממדיים ברזולוציה כמעט אטומית של מספר גדל במהירות של מקרומולקולות11. יתר על כן, על ידי מינוף האופי המולקולרי היחיד של הגישה, משתמשים יכולים לקבוע מבנים מרובים ממדגם יחיד 12,13,14,15, תוך הדגשת ההבטחה להשתמש בנתונים שנוצרו כדי להבין הרכבים מבניים הטרוגניים 16,17. למרות התקדמות זו, צווארי בקבוק בהכנת רשת דגימות הקפאה נמשכים.
עבור אפיון מבני על ידי cryoEM, דגימות ביולוגיות צריכות להיות מפוזרות היטב בתמיסה מימית ולאחר מכן יש להקפיא אותן באמצעות תהליך הנקרא ויטריפיקציה 18,19. המטרה היא ללכוד חלקיקים בשכבה דקה ואחידה של קרח מזוגג, המרחפים על פני חורים במרווחים קבועים, שבדרך כלל נחתכים לשכבה של פחמן אמורפי. רדיד פחמן אמורפי בדוגמה זו נתמך על ידי רשת TEM הנושאת רשת של מוטות תמיכה מנחושת או זהב. בתהליכי עבודה סטנדרטיים, רשתות הופכות הידרופיליות באמצעות טיפול פלזמה זוהר פריקה לפני יישום הדגימה. עודפי נוזל מוכתמים בנייר פילטר, מה שמאפשר לתמיסת החלבון ליצור שכבה נוזלית דקה על פני החורים שניתן לזגוג בקלות במהלך הקפאת צלילה. אתגרים נפוצים כוללים לוקליזציה של חלקיקים לממשק אוויר-מים (AWI) ודנטורציה עוקבת 20,21,22 או אימוץ כיוונים מועדפים 23,24,25, היצמדות חלקיקים לרדיד הפחמן במקום לנדוד לתוך החורים, והתקבצות וצבירה של החלקיקים בתוך החורים 26. עובי קרח לא אחיד הוא דאגה נוספת; קרח סמיך יכול לגרום לרמות גבוהות יותר של רעשי רקע במיקרוגרפים עקב פיזור אלקטרונים מוגבר, בעוד קרח דק במיוחד יכול להוציא חלקיקים גדולים יותר27.
כדי להתמודד עם אתגרים אלה, נעשה שימוש במגוון יריעות תמיכה דקות כדי לצפות משטחי רשת, המאפשרים לחלקיקים לנוח על תמיכות אלה, ובאופן אידיאלי, להימנע מאינטראקציות עם ממשק אוויר-מים. תומכי הגרפן הראו הבטחה גדולה, בין השאר בשל חוזקם המכני הגבוה יחד עם חתך הפיזור המינימלי שלהם, אשר מפחית את אות הרקע שנוסף על ידי שכבת התמיכה28. בנוסף לתרומתו המינימלית לרעשי רקע, הגרפן מפגין גם מוליכות חשמלית ותרמית יוצאת דופן29. רשתות מצופות גרפן ותחמוצת גרפן הוכחו כמניבות צפיפות חלקיקים גבוהה יותר, פיזור חלקיקים אחיד יותר30, ולוקליזציה מופחתת ל-AWI22. בנוסף, גרפן מספק משטח תמיכה שניתן לשנות עוד יותר כדי: 1) לכוונן את התכונות הפיזיוכימיות של משטח הרשת באמצעות פונקציונליות 31,32,33; או 2) סוכני קישור זוגיים המאפשרים טיהור זיקה של חלבונים בעלי עניין 34,35,36.
במאמר זה, שינינו נוהל קיים לציפוי רשתות cryoEM בשכבה אחידה אחת של גרפן30. השינויים נועדו למזער את הטיפול ברשת לאורך כל הפרוטוקול, במטרה להגדיל את התפוקה ואת יכולת השחזור. בנוסף, אנו דנים בגישה שלנו להערכת היעילות של טיפולי UV / אוזון שונים בהפיכת רשתות הידרופיליות לפני צלילה. שלב זה בהכנת דגימת cryoEM באמצעות רשתות מצופות גרפן הוא קריטי, ומצאנו שהשיטה הפשוטה שלנו לכמת את ההידרופיליות היחסית של הרשתות המתקבלות היא שימושית. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מדגימים את התועלת של שימוש ברשתות מצופות גרפן לקביעת מבנה על ידי יצירת שחזור תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של S. pyogenes Cas9 שאינו פעיל קטליטית בקומפלקס עם RNA מנחה ו- DNA מטרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכנת דגימות CryoEM כרוכה בשורה של אתגרים טכניים, כאשר רוב זרימות העבודה דורשות מהחוקרים לתפעל ידנית רשתות שבריריות בזהירות רבה כדי להימנע מפגיעה בהן. בנוסף, ההתאמה של כל דגימה לוויטריפיקציה היא בלתי צפויה; חלקיקים מתקשרים לעתים קרובות עם ממשק אוויר-מים או עם רדיד התמיכה המוצק המכסה את הרשתות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הדגימות הוכנו וצולמו במתקן CryoEM ב-MIT.nano על מיקרוסקופים שנרכשו הודות לקרן ארנולד ומייבל בקמן. מכשירי הדמיה של זווית מגע הודפסו ב-MIT Metropolis Maker Space. אנו מודים למעבדות של Nieng Yan ו-Yimo Han, ולצוות של MIT.nano על תמיכתם לאורך כל אימוץ שיטה זו. בפרט, אנו מודים לד”ר גואנהוי גאו ושרה סטרלינג על הדיונים והמשוב מלאי התובנה שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 ומענק NSF-CAREER 2046778. המחקר במעבדת דייוויס נתמך על ידי קרן אלפרד פ. סלואן, קרן ג’יימס ה. פרי, MIT J-Clinic ומשפחת וייטהד.
Materials
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2×2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
References
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
- Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
- Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
- Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).
- Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).
- Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).
- Dubochet, J. Cryo-EM–the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
- Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
- D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
- Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
- Geim, A. K., Novoselov, K. S. The rise of graphene. Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
- Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500 (2016).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
- Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).
- Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
- Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).
