Summary

Isolamento Fecal Murino e Transplante de Microbiota

Published: May 26, 2023
doi:

Summary

O objetivo aqui é delinear um protocolo para investigar os mecanismos de disbiose na doença cardiovascular. Este artigo discute como coletar e transplantar amostras fecais murinas assepticamente, isolar intestinos e usar o método “Swiss-roll”, seguido por técnicas de imunomarcação para interrogar alterações no trato gastrointestinal.

Abstract

A disbiose da microbiota intestinal desempenha um papel na fisiopatologia de distúrbios cardiovasculares e metabólicos, mas os mecanismos não são bem compreendidos. O transplante de microbiota fecal (FMT) é uma abordagem valiosa para delinear um papel direto da microbiota total ou de espécies isoladas na fisiopatologia da doença. É uma opção de tratamento segura para pacientes com infecção recorrente por Clostridium difficile . Estudos pré-clínicos demonstram que a manipulação da microbiota intestinal é uma ferramenta útil para estudar a ligação mecanicista entre disbiose e doença. O transplante de microbiota fecal pode ajudar a elucidar novas terapêuticas direcionadas à microbiota intestinal para o manejo e tratamento de doenças cardiometabólicas. Apesar de uma alta taxa de sucesso em roedores, ainda existem alterações translacionais associadas ao transplante. O objetivo aqui é fornecer orientação no estudo dos efeitos do microbioma intestinal em doenças cardiovasculares experimentais. Neste estudo, um protocolo detalhado para coleta, manuseio, processamento e transplante da microbiota fecal em estudos murinos é descrito. As etapas de coleta e processamento são descritas para doadores humanos e roedores. Finalmente, descrevemos o uso de uma combinação das técnicas de rolagem suíça e imunomarcação para avaliar alterações de morfologia e integridade específicas do intestino em doenças cardiovasculares e mecanismos relacionados da microbiota intestinal.

Introduction

Os distúrbios cardiometabólicos, incluindo doenças cardíacas e acidentes vasculares cerebrais, são as principais causas globais de morte1. Inatividade física, má nutrição, avanço da idade e genética modulam a fisiopatologia desses distúrbios. Evidências acumuladas apoiam o conceito de que a microbiota intestinal afeta distúrbios cardiovasculares e metabólicos,incluindo diabetes tipo 2 2, obesidade3 e hipertensão4, o que pode ser uma chave para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para essas doenças.

Os mecanismos exatos pelos quais a microbiota causa doenças ainda são desconhecidos, e os estudos atuais são altamente variáveis, em parte devido a diferenças metodológicas. O transplante de microbiota fecal (FMT) é uma abordagem valiosa para delinear um papel direto da microbiota total ou de espécies isoladas na fisiopatologia da doença. FMT é amplamente utilizado em estudos com animais para induzir ou suprimir um fenótipo. Por exemplo, a ingestão calórica e o metabolismo da glicose podem ser modulados pela transferência de matéria fecal de um doador doente para um receptor saudável 5,6. Em humanos, o FMT tem se mostrado uma opção segura de tratamento para pacientes com infecção recorrente por Clostridium difficile 7. Evidências que apoiam seu uso no manejo de doenças cardiovasculares estão surgindo; por exemplo, o FMT de pacientes magros a com síndrome metabólica melhora a sensibilidade à insulina8. A disbiose intestinal também está associada à hipertensão arterial em estudos com humanos e roedores 9,10,11. FMT de camundongos alimentados com dieta rica em sal em camundongos livres de germes predispõe os receptores à inflamação e hipertensão12.

Apesar da alta taxa de sucesso de FMT em roedores, os desafios translacionais permanecem. Ensaios clínicos utilizando o FMT no tratamento da obesidade e da síndrome metabólica indicam efeitos mínimos ou nulos sobre esses distúrbios13,14,15. Assim, mais estudos são necessários para identificar vias terapêuticas adicionais visando a microbiota intestinal para o tratamento de distúrbios cardiometabólicos. A maioria das evidências disponíveis sobre a microbiota intestinal e doenças cardiovasculares é associativa. O protocolo descrito discute como utilizar uma combinação de FMT e a técnica de rolamento suíço para mostrar uma associação entre doença e microbiota intestinal e avaliar diretamente a integridade de todas as partes do intestino intestinal16,17,18.

O objetivo geral deste método é fornecer orientação para o estudo dos efeitos do microbioma intestinal na doença cardiovascular experimental. Este protocolo fornece mais detalhes e considerações importantes no planejamento experimental para promover a tradução fisiológica e aumentar o rigor e a reprodutibilidade dos achados.

Protocol

O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Vanderbilt aprovou todos os procedimentos descritos neste manuscrito. Camundongos machos C57B1/6 aos 3 meses de idade, adquiridos do The Jackson Laboratory, foram alojados e cuidados de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 1. Coleta, armazenamento e processamento de amostras fecais humanas Coletar uma amostra de fezes, usando um recipiente estéril se o sujeito estiver na c…

Representative Results

As etapas descritas acima estão resumidas na Figura 1. O conteúdo cecal de camundongos ou fezes humanas são ressuspensos em soro fisiológico estéril para preparar uma pasta para dar a camundongos livres de germes (100 μL) por gavagem, primeiro por 3 dias consecutivos, depois uma vez a cada 3 dias. Ao final do protocolo, a pressão arterial é medida pelo método do manguito de cauda, camundongos são eutanasiados e tecidos são colhidos para avaliação de mudanças na microbiota intes…

Discussion

Uma abordagem valiosa para estudar o papel causal da microbiota intestinal em doenças cardiovasculares e metabólicas é transferir a microbiota total ou selecionar espécies de interesse para camundongos livres de germes. Aqui, descrevemos protocolos para coletar amostras fecais de humanos e camundongos convencionalmente alojados em camundongos livres de germes para estudar o papel da microbiota intestinal em doenças hipertensivas.

Em camundongos, usamos conteúdo cecal coletado assepticame…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado por Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (para A.K.) do National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (para J.A.I.); e National Heart, Lung, and Blood Institute Grants K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (para A.K.) e NIH grant 1P01HL116263 (para V.K.). A Figura 1 foi criada usando Biorender.

Materials

Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost ThermoFisher B40932
Anaerobic chamber COY 7150220
Apolipoprotein AI Novus Biologicals NBP2-52979
Artery Scissors – Ball Tip Fine Science Tools 14086-09
Bleach solution Fisher Scientific 14-412-53
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific B14
CD3 antibody ThermoFisher  14-0032-82
CD68 monoclonal antibody ThermoFisher 14-0681-82
Centrifuge Fisher Scientific 75-004-221
CODA high throughput monitor Kent Scientic Corporation CODA-HT8
Cryogenic vials Fisher Scientific 10-500-26
Disposable graduate transfer pipettes Fisher Scientific 137119AM
Disposable syringes Fisher Scientific 14-823-2A
Ethanol Fisher Scientific AA33361M1
Feeding Needle Fine Science Tools 18061-38
Filter (30 µm) Fisher Scientific NC0922459
Filter paper sheet Fisher Scientific 09-802
Formalin (10%) Fisher Scientific 23-730-581
High salt diet Teklad TD.03142
OMNIgene.GUT DNAgenotek OM-200+ACP102
Osmotic mini-pumps Alzet  MODEL 2002
PAP Pen Millipore Sigma Z377821-1EA
Petri dish Fisher Scientific AS4050
Pipette tips Fisher Scientific 21-236-18C
Pipettes Fisher Scientific 14-388-100
Serile Phosphate-buffered saline Fisher Scientific AAJ61196AP
Smart spatula Fisher Scientific NC0133733
Stool collection device Fisher Scientific 50-203-7255
TBS Buffer Fisher Scientific R017R.0000
Triton X-100 Millipore Sigma
9036-19-5
Varimix platform rocker Fisher Scientific 09047113Q
Vortex mixer Fisher Scientific 02-215-41
Xylene Fisher Scientific 1330-20-7, 100-41-4

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Cite This Article
Ishimwe, J. A., Zhong, J., Kon, V., Kirabo, A. Murine Fecal Isolation and Microbiota Transplantation. J. Vis. Exp. (195), e64310, doi:10.3791/64310 (2023).

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