Murine fecale isolatie en microbiota transplantatie
Summary
Het doel hier is om een protocol te schetsen om de mechanismen van dysbiose bij hart- en vaatziekten te onderzoeken. Dit artikel bespreekt hoe aseptisch muizenfecale monsters kunnen worden verzameld en getransplanteerd, darmen kunnen worden geïsoleerd en de “Swiss-roll” -methode kan worden gebruikt, gevolgd door immunostainingtechnieken om veranderingen in het maagdarmkanaal te onderzoeken.
Abstract
Darmmicrobiota dysbiose speelt een rol in de pathofysiologie van cardiovasculaire en metabole stoornissen, maar de mechanismen zijn niet goed begrepen. Fecale microbiotatransplantatie (FMT) is een waardevolle benadering voor het afbakenen van een directe rol van de totale microbiota of geïsoleerde soorten in de pathofysiologie van ziekten. Het is een veilige behandelingsoptie voor patiënten met een terugkerende Clostridium difficile-infectie . Preklinische studies tonen aan dat het manipuleren van de darmmicrobiota een nuttig hulpmiddel is om het mechanistische verband tussen dysbiose en ziekte te bestuderen. Fecale microbiotatransplantatie kan helpen bij het ophelderen van nieuwe darmmicrobiota-gerichte therapieën voor het beheer en de behandeling van cardiometabole ziekten. Ondanks een hoog slagingspercentage bij knaagdieren, blijven er translationele veranderingen geassocieerd met de transplantatie. Het doel hier is om begeleiding te bieden bij het bestuderen van de effecten van darmmicrobioom bij experimentele hart- en vaatziekten. In deze studie wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor het verzamelen, hanteren, verwerken en transplanteren van fecale microbiota in muizenstudies. De verzamel- en verwerkingsstappen worden beschreven voor zowel menselijke als knaagdierdonoren. Ten slotte beschrijven we het gebruik van een combinatie van de Zwitserse rol- en immunostainingtechnieken om darmspecifieke morfologie en integriteitsveranderingen in hart- en vaatziekten en gerelateerde darmmicrobiota-mechanismen te beoordelen.
Introduction
Cardiometabole aandoeningen, waaronder hartaandoeningen en beroertes, zijn de belangrijkste wereldwijde doodsoorzaken1. Lichamelijke inactiviteit, slechte voeding, voortschrijdende leeftijd en genetica moduleren de pathofysiologie van deze aandoeningen. Accumulerend bewijs ondersteunt het concept dat darmmicrobiota cardiovasculaire en metabole stoornissen beïnvloeden, waaronder type 2 diabetes2, obesitas3 en hypertensie4, die een sleutel kunnen zijn tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen voor deze ziekten.
De exacte mechanismen waarmee de microbiota ziekten veroorzaken, zijn nog onbekend en de huidige studies zijn zeer variabel, deels als gevolg van methodologische verschillen. Fecale microbiotatransplantatie (FMT) is een waardevolle benadering voor het afbakenen van een directe rol van de totale microbiota of geïsoleerde soorten in de pathofysiologie van ziekten. FMT wordt veel gebruikt in dierstudies om een fenotype te induceren of te onderdrukken. Calorie-inname en glucosemetabolisme kunnen bijvoorbeeld worden gemoduleerd door fecale materie van een zieke donor over te brengen naar een gezonde ontvanger 5,6. Bij mensen is aangetoond dat FMT een veilige behandelingsoptie is voor patiënten met recidiverende Clostridium difficile-infectie 7. Er is bewijs dat het gebruik ervan bij het beheer van hart- en vaatziekten ondersteunt; FMT van patiënten met mager tot metabool syndroom verbetert bijvoorbeeld de insulinegevoeligheid8. Darmdysbiose wordt ook geassocieerd met hoge bloeddruk in zowel menselijke als knaagdierstudies 9,10,11. FMT van muizen die een zoutrijk dieet kregen in kiemvrije muizen maakt de ontvangers vatbaar voor ontsteking en hypertensie12.
Ondanks het hoge percentage FMT-succes bij knaagdieren, blijven translationele uitdagingen bestaan. Klinische studies met FMT voor de behandeling van obesitas en metabool syndroom geven minimale tot geen effecten op deze aandoeningen13,14,15. Er zijn dus meer studies nodig om aanvullende therapeutische wegen te identificeren die zich richten op de darmmicrobiota voor de behandeling van cardiometabole stoornissen. Het meeste beschikbare bewijs over de darmmicrobiota en hart- en vaatziekten is associatief. Het beschreven protocol bespreekt hoe een combinatie van FMT en de Zwitserse roltechniek kan worden gebruikt om zowel een verband tussen ziekte en darmmicrobiota aan te tonen als de integriteit van alle delen van de darmdarm direct te beoordelen16,17,18.
Het algemene doel van deze methode is om richtlijnen te bieden voor het bestuderen van de effecten van het darmmicrobioom bij experimentele hart- en vaatziekten. Dit protocol biedt meer details en belangrijke overwegingen in het experimentele ontwerp om fysiologische vertaling te bevorderen en de striktheid en reproduceerbaarheid van de bevindingen te vergroten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een waardevolle benadering voor het bestuderen van de causale rol van darmmicrobiota bij cardiovasculaire en metabole ziekten is om de totale microbiota over te brengen of interessante soorten te selecteren in kiemvrije muizen. Hier beschrijven we protocollen om fecale monsters van mensen en conventioneel gehuisveste muizen te verzamelen in kiemvrije muizen om de rol van darmmicrobiota bij hypertensieve aandoeningen te bestuderen.
Bij muizen gebruiken we aseptisch verzamelde cecale inhoud verw…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (naar A.K.) van het National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (aan J.A.I.); en National Heart, Lung, and Blood Institute Grants K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (aan A.K.), en NIH-subsidie 1P01HL116263 (aan V.K.). Figuur 1 is gemaakt met Biorender.
Materials
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study. Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).
- Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).
- Avery, E. G., et al. The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives. Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).
- Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice. Scientific Reports. 10 (1), 9388 (2020).
- Zoll, J., et al. Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).
- Hvas, C. L., et al. Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection. Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).
- Kootte, R. S., et al. Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition. Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).
- Li, J., et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension. Microbiome. 5 (1), 14 (2017).
- Shi, H., et al. Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure. Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).
- Zhong, H. J., et al. Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624 (2021).
- Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
- Yu, E. W., et al. Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial. PLoS Medicine. 17 (3), 1003051 (2020).
- Leong, K. S. W., et al. Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial. JAMA Network Open. 3 (12), 2030415 (2020).
- Zhang, Z., et al. Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review. Nutrients. 11 (10), 2291 (2019).
- Laubitz, D., et al. Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study). Microorganisms. 9 (3), 647 (2021).
- Xiao, L., et al. High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice. Microbiome. 5 (1), 43 (2017).
- Brunt, V. E., et al. Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice. The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).
- Choo, J. M., Rogers, G. B. Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice. STAR Protocols. 2 (3), 100610 (2021).
- Kim, T. T., et al. Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice. Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).
- Ishimwe, J. A., et al. The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome. Frontiers in Physiology. 13, 879012 (2022).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).
- Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. 1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).
- Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055 (2021).
- Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (145), e59124 (2019).
- Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M. Vascular inflammatory cells in hypertension. Frontiers in Physiology. 3, 128 (2012).
- Sylvester, M. A., et al. Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).
- Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), 17996 (2011).
- Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Frontiers in Microbiology. 9, 3289 (2019).
- Sun, J., et al. Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer’s disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice. Translation Psychiatry. 9 (1), 189 (2019).
- Kim, M., et al. Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses. Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
- Liu, X., et al. High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis. Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).
