Summary

عزل براز الفئران وزرع الجراثيم

Published: May 26, 2023
doi:

Summary

الهدف هنا هو تحديد بروتوكول للتحقيق في آليات dysbiosis في أمراض القلب والأوعية الدموية. تناقش هذه الورقة كيفية جمع عينات براز الفئران وزرعها بشكل معقم ، وعزل الأمعاء ، واستخدام طريقة “Swiss-roll” ، تليها تقنيات التلوين المناعي لاستجواب التغيرات في الجهاز الهضمي.

Abstract

يلعب dysbiosis microbiota الأمعاء دورا في الفيزيولوجيا المرضية لاضطرابات القلب والأوعية الدموية والتمثيل الغذائي ، ولكن الآليات ليست مفهومة جيدا. زرع الجراثيم البرازية (FMT) هو نهج قيم لتحديد الدور المباشر للميكروبات الكلية أو الأنواع المعزولة في الفيزيولوجيا المرضية للمرض. إنه خيار علاج آمن للمرضى الذين يعانون من عدوى المطثية العسيرة المتكررة. تظهر الدراسات قبل السريرية أن التلاعب بميكروبيوتا الأمعاء هو أداة مفيدة لدراسة العلاقة الميكانيكية بين dysbiosis والمرض. قد تساعد زراعة الجراثيم البرازية في توضيح العلاجات الجديدة التي تستهدف ميكروبيوتا الأمعاء لإدارة وعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية. على الرغم من ارتفاع معدل النجاح في القوارض ، لا تزال هناك تغييرات متعدية مرتبطة بعملية الزرع. الهدف هنا هو تقديم إرشادات في دراسة آثار ميكروبيوم الأمعاء في أمراض القلب والأوعية الدموية التجريبية. في هذه الدراسة ، تم وصف بروتوكول مفصل لجمع ومعالجة ومعالجة وزرع الجراثيم البرازية في دراسات الفئران. يتم وصف خطوات الجمع والمعالجة لكل من المتبرعين من البشر والقوارض. أخيرا ، وصفنا استخدام مزيج من تقنيات التدحرج السويسري والمناعة لتقييم التشكل الخاص بالأمعاء وتغيرات النزاهة في أمراض القلب والأوعية الدموية وآليات ميكروبيوتا الأمعاء ذات الصلة.

Introduction

اضطرابات القلب والأوعية الدموية ، بما في ذلك أمراض القلب والسكتة الدماغية ، هي الأسباب العالمية الرئيسية للوفاة1. الخمول البدني ، وسوء التغذية ، والتقدم في العمر ، وعلم الوراثة تعدل الفيزيولوجيا المرضية لهذه الاضطرابات. تدعم الأدلة المتراكمة المفهوم القائل بأن ميكروبيوتا الأمعاء تؤثر على اضطرابات القلب والأوعية الدموية والتمثيل الغذائي ، بما في ذلك مرض السكريمن النوع 2 2 والسمنة3 وارتفاع ضغط الدم4 ، والتي قد تحمل مفتاحا لتطوير مناهج علاجية جديدة لهذه الأمراض.

لا تزال الآليات الدقيقة التي تسبب بها الكائنات الحية الدقيقة الأمراض غير معروفة ، والدراسات الحالية متغيرة للغاية ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الاختلافات المنهجية. زرع الجراثيم البرازية (FMT) هو نهج قيم لتحديد الدور المباشر للميكروبات الكلية أو الأنواع المعزولة في الفيزيولوجيا المرضية للمرض. يستخدم FMT على نطاق واسع في الدراسات على الحيوانات للحث على النمط الظاهري أو قمعه. على سبيل المثال ، يمكن تعديل السعرات الحرارية واستقلاب الجلوكوز عن طريق نقل البراز من متبرع مريض إلى متلقي صحي 5,6. في البشر، ثبت أن FMT هو خيار علاج آمن للمرضى الذين يعانون من عدوى المطثية العسيرة المتكررة 7. تظهر أدلة تدعم استخدامه في إدارة أمراض القلب والأوعية الدموية. على سبيل المثال ، FMT من العجاف إلى مرضى متلازمة التمثيل الغذائي يحسن حساسية الأنسولين8. يرتبط dysbiosis الأمعاء أيضا بارتفاع ضغط الدم في كل من الدراسات البشرية والقوارض9،10،11. FMT من الفئران التي تتغذى على نظام غذائي عالي الملح في الفئران الخالية من الجراثيم يهيئ المتلقين للالتهاب وارتفاع ضغط الدم12.

على الرغم من ارتفاع معدل نجاح FMT في القوارض ، لا تزال هناك تحديات متعدية. تشير التجارب السريرية التي تستخدم FMT لعلاج السمنة ومتلازمة التمثيل الغذائي إلى آثار ضئيلة أو معدومة على هذه الاضطرابات13،14،15. وبالتالي ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد طرق علاجية إضافية تستهدف ميكروبيوتا الأمعاء لعلاج اضطرابات القلب والأوعية الدموية. معظم الأدلة المتاحة على ميكروبيوتا الأمعاء وأمراض القلب والأوعية الدموية هي ترابطية. يناقش البروتوكول الموصوف كيفية استخدام مزيج من FMT وتقنية Swiss-rolling لإظهار كل من الارتباط بين المرض وميكروبات الأمعاء وتقييم سلامة جميع أجزاء الأمعاء بشكل مباشر16،17،18.

الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير إرشادات لدراسة آثار ميكروبيوم الأمعاء في أمراض القلب والأوعية الدموية التجريبية. يوفر هذا البروتوكول مزيدا من التفاصيل والاعتبارات الرئيسية في التصميم التجريبي لتعزيز الترجمة الفسيولوجية وزيادة دقة النتائج واستنساخها.

Protocol

وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة فاندربيلت على جميع الإجراءات الموضحة في هذه المخطوطة. تم إيواء الفئران الذكور C57B1 / 6 في عمر 3 أشهر ، والتي تم شراؤها من مختبر جاكسون ، ورعايتها وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر. 1. جمع وتخزين ومعالجة عينات البراز الب…

Representative Results

يتم تلخيص الخطوات الموضحة أعلاه في الشكل 1. يتم إعادة تعليق محتويات الفئران أو البراز البشري في محلول ملحي معقم لإعداد ملاط لإعطائه للفئران الخالية من الجراثيم (100 ميكرولتر) عن طريق التزويج ، أولا لمدة 3 أيام متتالية ، ثم مرة واحدة كل 3 أيام. في نهاية البروتوكول ، يتم قياس ضغط …

Discussion

يتمثل أحد الأساليب القيمة لدراسة الدور السببي لميكروبيوتا الأمعاء في أمراض القلب والأوعية الدموية والتمثيل الغذائي في نقل الجراثيم الكلية أو اختيار الأنواع ذات الأهمية إلى الفئران الخالية من الجراثيم. هنا ، نصف بروتوكولات لجمع عينات البراز من البشر والفئران الموجودة تقليديا في الفئران…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل منحة جائزة فاندربيلت للعلوم السريرية والانتقالية UL1TR002243 (إلى AK) من المركز الوطني لتطوير العلوم الانتقالية. منحة جمعية القلب الأمريكية POST903428 (إلى J.A.I.) ؛ ومنح المعهد الوطني للقلب والرئة والدم K01HL13049 و R03HL155041 و R01HL144941 (إلى AK) ومنحة المعاهد الوطنية للصحة 1P01HL116263 (إلى V.K.). تم إنشاء الشكل 1 باستخدام Biorender.

Materials

Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost ThermoFisher B40932
Anaerobic chamber COY 7150220
Apolipoprotein AI Novus Biologicals NBP2-52979
Artery Scissors – Ball Tip Fine Science Tools 14086-09
Bleach solution Fisher Scientific 14-412-53
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific B14
CD3 antibody ThermoFisher  14-0032-82
CD68 monoclonal antibody ThermoFisher 14-0681-82
Centrifuge Fisher Scientific 75-004-221
CODA high throughput monitor Kent Scientic Corporation CODA-HT8
Cryogenic vials Fisher Scientific 10-500-26
Disposable graduate transfer pipettes Fisher Scientific 137119AM
Disposable syringes Fisher Scientific 14-823-2A
Ethanol Fisher Scientific AA33361M1
Feeding Needle Fine Science Tools 18061-38
Filter (30 µm) Fisher Scientific NC0922459
Filter paper sheet Fisher Scientific 09-802
Formalin (10%) Fisher Scientific 23-730-581
High salt diet Teklad TD.03142
OMNIgene.GUT DNAgenotek OM-200+ACP102
Osmotic mini-pumps Alzet  MODEL 2002
PAP Pen Millipore Sigma Z377821-1EA
Petri dish Fisher Scientific AS4050
Pipette tips Fisher Scientific 21-236-18C
Pipettes Fisher Scientific 14-388-100
Serile Phosphate-buffered saline Fisher Scientific AAJ61196AP
Smart spatula Fisher Scientific NC0133733
Stool collection device Fisher Scientific 50-203-7255
TBS Buffer Fisher Scientific R017R.0000
Triton X-100 Millipore Sigma
9036-19-5
Varimix platform rocker Fisher Scientific 09047113Q
Vortex mixer Fisher Scientific 02-215-41
Xylene Fisher Scientific 1330-20-7, 100-41-4

References

  1. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
  2. Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study. Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).
  3. Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).
  4. Avery, E. G., et al. The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives. Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).
  5. Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice. Scientific Reports. 10 (1), 9388 (2020).
  6. Zoll, J., et al. Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).
  7. Hvas, C. L., et al. Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection. Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).
  8. Kootte, R. S., et al. Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition. Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).
  9. Li, J., et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension. Microbiome. 5 (1), 14 (2017).
  10. Shi, H., et al. Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure. Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).
  11. Zhong, H. J., et al. Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624 (2021).
  12. Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
  13. Yu, E. W., et al. Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial. PLoS Medicine. 17 (3), 1003051 (2020).
  14. Leong, K. S. W., et al. Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial. JAMA Network Open. 3 (12), 2030415 (2020).
  15. Zhang, Z., et al. Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review. Nutrients. 11 (10), 2291 (2019).
  16. Laubitz, D., et al. Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study). Microorganisms. 9 (3), 647 (2021).
  17. Xiao, L., et al. High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice. Microbiome. 5 (1), 43 (2017).
  18. Brunt, V. E., et al. Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice. The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).
  19. Choo, J. M., Rogers, G. B. Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice. STAR Protocols. 2 (3), 100610 (2021).
  20. Kim, T. T., et al. Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).
  21. Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
  22. Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice. Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).
  23. Ishimwe, J. A., et al. The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome. Frontiers in Physiology. 13, 879012 (2022).
  24. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  25. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).
  26. Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. 1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).
  27. Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055 (2021).
  28. Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (145), e59124 (2019).
  29. Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M. Vascular inflammatory cells in hypertension. Frontiers in Physiology. 3, 128 (2012).
  30. Sylvester, M. A., et al. Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).
  31. Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), 17996 (2011).
  32. Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Frontiers in Microbiology. 9, 3289 (2019).
  33. Sun, J., et al. Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer’s disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice. Translation Psychiatry. 9 (1), 189 (2019).
  34. Kim, M., et al. Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses. Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).
  35. Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
  36. Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
  37. Liu, X., et al. High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis. Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).

Play Video

Cite This Article
Ishimwe, J. A., Zhong, J., Kon, V., Kirabo, A. Murine Fecal Isolation and Microbiota Transplantation. J. Vis. Exp. (195), e64310, doi:10.3791/64310 (2023).

View Video