쥐 분변 분리 및 미생물군 이식
Summary
여기서 목표는 심혈관 질환에서 dysbiosis의 메커니즘을 조사하기 위한 프로토콜을 설명하는 것입니다. 이 논문은 쥐 분변 샘플을 무균적으로 수집 및 이식하고, 장을 분리하고, “Swiss-roll” 방법을 사용한 다음 면역염색 기술을 사용하여 위장관의 변화를 조사하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
장내 미생물 dysbiosis는 심혈관 및 대사 장애의 병태생리학에서 중요한 역할을 하지만 그 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 분변 미생물군 이식(FMT)은 질병 병태생리학에서 전체 미생물군 또는 분리된 종의 직접적인 역할을 설명하는 귀중한 접근 방식입니다. 재발성 클로스트리디움 디피실 감염 환자에게 안전한 치료 옵션입니다. 전임상 연구에 따르면 장내 미생물군을 조작하는 것이 dysbiosis와 질병 사이의 기계적 연관성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 분변 미생물군 이식은 심혈관 질환의 관리 및 치료를 위한 새로운 장내 미생물군 표적 치료제를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 설치류의 높은 성공률에도 불구하고 이식과 관련된 번역 변화가 남아 있습니다. 여기서 목표는 실험적 심혈관 질환에서 장내 미생물군집의 영향을 연구하는 데 지침을 제공하는 것입니다. 이 연구에서는 쥐 연구에서 분변 미생물총의 수집, 취급, 처리 및 이식에 대한 자세한 프로토콜이 설명됩니다. 수집 및 처리 단계는 인간 및 설치류 기증자 모두에 대해 설명됩니다. 마지막으로, 우리는 심혈관 질환 및 관련 장내 미생물군 메커니즘의 장 특이적 형태 및 무결성 변화를 평가하기 위해 스위스 롤링 및 면역 염색 기술의 조합을 사용하여 설명합니다.
Introduction
심장병과 뇌졸중을 포함한 심장 대사 장애는 전 세계 주요 사망 원인입니다1. 신체 활동 부족, 영양 부족, 노화 및 유전학은 이러한 장애의 병태생리학을 조절합니다. 축적된 증거는 장내 미생물군이 제2형 당뇨병2, 비만3, 고혈압4을 포함한 심혈관 및 대사 장애에 영향을 미친다는 개념을 뒷받침하며, 이는 이러한 질병에 대한 새로운 치료법 개발의 열쇠가 될 수 있습니다.
미생물군이 질병을 일으키는 정확한 메커니즘은 아직 알려지지 않았으며, 부분적으로는 방법론적 차이로 인해 현재 연구는 매우 다양합니다. 분변 미생물군 이식(FMT)은 질병 병태생리학에서 전체 미생물군 또는 분리된 종의 직접적인 역할을 설명하는 귀중한 접근 방식입니다. FMT는 표현형을 유도하거나 억제하기 위해 동물 연구에서 널리 사용됩니다. 예를 들어, 칼로리 섭취 및 포도당 대사는 배설물을 아픈 기증자로부터 건강한 수혜자에게 전달함으로써 조절될 수 있다 5,6. 인간의 경우, FMT는 클로스트리디움 디피실 감염이 재발하는 환자에게 안전한 치료 옵션인 것으로 나타났다7. 심혈관 질환 관리에 대한 사용을 뒷받침하는 증거가 나타나고 있습니다. 예를 들어, 희박한 대사 증후군 환자에서 FMT는 인슐린 감수성을 개선한다8. 장내 dysbiosis는 또한 인간 및 설치류 연구모두에서 고혈압과 관련이 있습니다 9,10,11. 무균 생쥐에 고염식을 먹인 생쥐의 FMT는 수혜자가 염증과 고혈압에 걸리기 쉽다12.
설치류에서 FMT 성공률이 높음에도 불구하고 번역 문제는 여전히 남아 있습니다. 비만과 대사증후군을 치료하기 위해 FMT를 사용한 임상 시험은 이러한 장애에 대한 영향이 미미하거나 전혀 없음을 나타냅니다13,14,15. 따라서 심장 대사 장애 치료를 위해 장내 미생물군을 표적으로 하는 추가 치료 방법을 식별하기 위해서는 더 많은 연구가 필요합니다. 장내 미생물군과 심혈관 질환에 대한 이용 가능한 증거의 대부분은 연관성이 있습니다. 설명된 프로토콜은 질병과 장내 미생물군 사이의 연관성을 보여주고 장내 모든 부분의 무결성을 직접 평가하기 위해 FMT와 스위스 롤링 기술의 조합을 활용하는 방법에 대해 논의합니다16,17,18.
이 방법의 전반적인 목표는 실험적 심혈관 질환에서 장내 미생물군집의 영향을 연구하기 위한 지침을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 생리학적 번역을 촉진하고 결과의 엄격함과 재현성을 높이기 위해 실험 설계에서 더 많은 세부 사항과 주요 고려 사항을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
심혈관 및 대사 질환에서 장내 미생물총의 인과적 역할을 연구하는 귀중한 접근 방식은 전체 미생물군 또는 선별된 관심 종을 무균 마우스로 옮기는 것입니다. 여기에서 우리는 고혈압 장애에서 장내 미생물총의 역할을 연구하기 위해 인간과 전통적으로 수용된 쥐의 배설물 샘플을 무균 생쥐로 수집하는 프로토콜을 설명합니다.
생쥐에서는 호기성실에서 처리 된 무균 수집 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 National Center for Advancing Translational Sciences의 Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243(to A.K.)의 지원을 받았습니다. 미국 심장 협회 보조금 POST903428 (JAI에); 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소는 K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941(AK로) 보조금을 부여하고 NIH는 1P01HL116263(VK로)을 부여합니다. 그림 1 은 Biorender를 사용하여 생성되었습니다.
Materials
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
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