Summary

عزل الخلايا البدائية عن أجنة الدجاج اللاحم

Published: August 04, 2022
doi:

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل الخلايا الدهنية من الأنسجة الدهنية في أجنة اللاحم. تتيح هذه الطريقة العزل مع غلة عالية ، والثقافة الأولية ، والتمايز الشحمي للخلايا الدهنية. قام تلطيخ الزيت الأحمر O وبقع الدهون / الحمض النووي بقياس القدرة الشحمية للخلايا المعزولة المستحثة بوسائط التمايز.

Abstract

الخلايا الشحمية الأولية هي نظام تجريبي قيم لفهم المسارات الجزيئية التي تتحكم في تمايز الخلايا الشحمية والتمثيل الغذائي. توفر أجنة الدجاج الفرصة لعزل الخلايا الشهية من المرحلة المبكرة من التطور الدهني. يمكن استخدام هذه الخلية الأولية لتحديد العوامل التي تؤثر على انتشار الخلايا ما قبل الشحمية والتمايز الشحمي المنشأ ، مما يجعلها نموذجا قيما للدراسات المتعلقة بالسمنة في مرحلة الطفولة والسيطرة على ترسب الدهون الزائدة في الدواجن. النمو السريع للأنسجة الدهنية بعد الولادة يهدر الأعلاف بشكل فعال عن طريق تخصيصها بعيدا عن نمو العضلات في الدجاج اللاحم. لذلك ، قد توفر طرق فهم المراحل المبكرة من تطور الأنسجة الدهنية أدلة لتنظيم هذا الميل وتحديد طرق للحد من توسع الدهون في وقت مبكر من الحياة. تم تصميم هذه الدراسة لتطوير طريقة فعالة للعزل ، والثقافة الأولية ، والتمايز الشحمي المنشأ للخلايا الشهية المعزولة عن تطوير الأنسجة الدهنية لأجنة الدجاج اللاحم التجاري (نوع اللحوم). تم تحسين الإجراء لإنتاج خلايا ذات صلاحية عالية (~ 98٪) وزيادة القدرة على التمايز إلى خلايا دهنية ناضجة. تدعم هذه الطريقة البسيطة لعزل الخلايا المعقدة، وثقافتها، وتمايزها التحليلات الوظيفية لنمو الدهون وتطورها في الحياة المبكرة.

Introduction

السمنة هي تهديد صحي عالمي لكل من البالغين والأطفال. الأطفال الذين يعانون من زيادة الوزن أو السمنة هم أكثر عرضة بخمس مرات تقريبا للإصابة بالسمنة مثل البالغين ، مما يعرضهم لخطر متزايد بشكل كبير للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية والسكري والعديد من الأمراض المصاحبة الأخرى. حوالي 13.4٪ من الأطفال الأمريكيين الذين تتراوح أعمارهم بين 2-5 يعانون من السمنة1 ، مما يدل على أن الميل إلى تراكم الدهون الزائدة في الجسم يمكن أن يبدأ في وقت مبكر جدا من الحياة. لأسباب مختلفة جدا ، فإن تراكم الأنسجة الدهنية الزائدة هو مصدر قلق للدجاج اللاحم (نوع اللحوم). اللاحم الحديث فعال بشكل لا يصدق ولكن لا يزال يتراكم المزيد من الدهون مما هو ضروري من الناحية الفسيولوجية 2,3. يبدأ هذا الاتجاه بعد فترة وجيزة من الفقس ويهدر الأعلاف بشكل فعال ، وهو أغلى مكون إنتاج ، عن طريق تخصيصه بعيدا عن نمو العضلات. لذلك ، بالنسبة لكل من الأطفال والدجاج اللاحم ، وإن كان ذلك لأسباب مختلفة للغاية ، هناك حاجة لفهم العوامل التي تؤثر على نمو الأنسجة الدهنية وتحديد طرق للحد من توسع الدهون في وقت مبكر من الحياة.

تتشكل الخلايا الشحمية من الخلايا الدهنية ، وهي خلايا جذعية مشتقة من الأنسجة الدهنية تخضع للتمايز لتطوير خلايا دهنية ناضجة تخزن الدهون. وفقا لذلك ، فإن الخلايا البدائية في المختبر هي نموذج تجريبي قيم لدراسات السمنة. هذه الخلايا ، المعزولة عن الجزء الوعائي اللحمية من المستودعات الدهنية ، يمكن أن توفر فهما أساسيا للمسارات الجزيئية التي تتحكم في تمايز الخلايا الشحمية والتمثيل الغذائي 4,5. تعتبر أجنة الكتاكيت نموذجا تجريبيا مواتيا في الدراسات التنموية لأن زراعة البيض وفقا للجدول الزمني المطلوب يجعل التلاعب التجريبي أسهل ، لأنه يتيح الحصول على الأجنة دون تضحية الأم لمراقبة سلسلة من مراحل نمو الأجنة. علاوة على ذلك ، لا يلزم إجراء عمليات جراحية معقدة وفترات زمنية طويلة للحصول على الأجنة مقارنة بالنماذج الحيوانية الأكبر. لذلك ، يقدم جنين الفرخ فرصة للحصول على الخلايا الدهنية من المراحل المبكرة من تطور الأنسجة الدهنية. تصبح الأنسجة الدهنية تحت الجلد مرئية في الفرخ حول اليوم الجنيني 12 (E12) كمستودع محدد بوضوح يقع حول الفخذ. يتم إثراء هذا المستودع في الخلايا الشحمية عالية التكاثر التي تخضع بنشاط للتمايز تحت إشارات تنموية لتشكيل الخلايا الشحمية الناضجة 6,7. عملية التمايز الشحمي قابلة للمقارنة بين الدجاج والبشر. لذلك ، يمكن استخدام الخلايا البدائية المعزولة من أجنة الكتاكيت كنموذج مزدوج الغرض للدراسات ذات الصلة بالبشر والدواجن. ومع ذلك ، فإن غلة الخلايا الدهنية الأولية تنخفض مع الشيخوخة حيث تنمو الخلايا إلى الخلايا الشحمية الناضجة5.

يعمل البروتوكول الحالي على تحسين عزل الخلايا الدهنية عن الأنسجة الدهنية خلال المرحلة (E16-E18) التي يكون فيها التمايز الشحمي المنشأ وتضخم الخلايا الشحمية في ذروتهما في أجنة الفرخ اللاحم8. يمكن لهذا الإجراء تقييم آثار العوامل التي يتعرض لها الجنين النامي في البيضاوة ، مثل النظام الغذائي للدجاجة ، على تطور الخلايا الشحمية والإمكانات الشحمية خارج الجسم الحي. ويمكنه أيضا اختبار تأثير التلاعب المختلفة (على سبيل المثال ، نقص الأكسجة ، وإضافات المغذيات ، والناهضات الدوائية ، والخصوم) على تكوين الدهون أو مختلف ‘omes’ (على سبيل المثال ، transcriptome ، metabolome ، methylome) من أسلاف الخلايا الشحمية. كتمثيل للمرحلة المبكرة من تكوين الدهون ، تعد الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول نماذج قيمة للدراسات ذات الصلة بالدواجن والبشر.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة تينيسي. تم الحصول على بيض اللاحم التجاري المخصب حديثا (Cobb 500) من مفرخ محلي. تم احتضان البيض عند 38 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 60٪ حتى تشريحه في الأيام الجنينية 16-18 (E16-E18). تم جمع الأنسجة الدهنية من الم?…

Representative Results

تشبه الخلايا الأولية البدائية من الناحية المورفولوجية الخلايا الليفية ، مع أشكال غير منتظمة تشبه النجوم ونواة مركزية (الشكل 2A-C). تلتصق الخلايا بسهولة بالبلاستيك المزروع بالأنسجة وتبدأ في التكاثر بعد فترة وجيزة من التعلق. فهي تميز بسرعة وتتراكم قطرات ال?…

Discussion

على الرغم من أن العديد من البروتوكولات الموصوفة جيدا قد أبلغت عن عزل الخلايا الشهية14،15،16،17 ، فقد تم تحسين عزل الخلايا الشهية الجنينية ، والتي يمكن استخدامها للتحليلات الوظيفية لنمو الدهون في وقت مبكر من الحياة وتطورها في فر…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون UT AgResearch وقسم علوم الحيوان على دعم وتحسين هذا البروتوكول. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة وزارة الزراعة الأمريكية.

Materials

1 mL Pipette Eppendorf Z683825 Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL
1 mL Pipette Tip Fisher Scientific 02-707-402
100% Isopropanol Fisher Scientific A426P4
1x PBS Gibco 10010023
25 mL Flask Pyrex 4980-25
37% Formaldehyde Fisher Scientific F75P-1GAL
6-Well Plate Falcon 353046 Tissue Culture-treated
96-Well Assay Plate Costar 3632
96-Well Plate, Black Bottom Costar 3603 Tissue Culture-treated
AdipoRed Lonza PT-7009
Amphotericin B Gibco 15290026
Bench Top Wiper (Kimtechwiper) Kimberly-Clark 34155
Betadine Up & Up NDC 1167300334 20% Working Solution
Cell Counter Corning 6749
Cell Strainer, 40 µm SPL 93040
Centrifugaton Eppendorf 5702
Chicken Serum Gibco 16110082
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL VWR 10025-690
Conical Centrifuge Tubes, 50 mL Falcon 352098
Cryovial Nunc 343958
Curved Forceps, 100 mm Roboz Surgical RS-5137
Curved Surgical Scissors, 115 mm Roboz Surgical RS-6839
Distilled Water Millipore SYNSV0000 Despensed as needed
DMEM/F12 HyClone SH30023.01
DMSO Sigma D2650
Ethanol Decon Labs 2701 70% Working Solution
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10437028
Fluorescent Microscope Evos M7000
Fluorescent Plate Reader Biotek Synergy H1
Foil Reynolds Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.
Freezing Container Thermo Scientific 5100-0001
Gelatin Millipore 4055 2% Working Solution
Hematocytometer (Counting Chamber) Corning 480200 0.1 mm deep
Incubator Fisher Scientific 6845
Instrument Sterilizer VWR B1205
Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin Sigma L9655 1x Working Solution
Microscope Evos AMEX1000
Multi-Channel Pipette Thermo Scientific 4661070 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL
Na2HPO4 Sigma S-7907
NaH2PO4 Sigma S-3139
NucBlue Invitrogen R37605
Oil Red O Sigma O-0625
Orbital Shaker IKA KS130BS1
Paper Towel Tork RK8002
Parafilm Parafilm M PM996
Penicillin/Steptomycin (P/S) Gibco 15140122 1x Working Solution
Petri dishes, 100 mm Falcon 351029
Petri dishes, 60 mm Falcon 351007
Plate Shaker VWR 200
RBC Lysis Buffer Roche 11814389001
Reagent Reservior VWR 89094-680
Small Beaker, 100 mL Pyrex 1000-100
Spectrophotometer Plate Reader Biotek Synergy H1
Sterile Gauze McKesson 762703
Straight Forceps, 120 mm Roboz Surgical RS-4960
Straight Scissors, 140 mm Roboz Surgical RS-6762
T-25 Flask Corning 430639 Tissue Culture-treated
Tissue Culture Incubator Thermo Scientific 50144906
Tissue Strainer, 250 µm Pierce 87791
Trypan Blue Stain Gibco 15250061
Trypsin Gibco 15400054 0.1% Working Solution
Tweezers, 110 mm Roboz Surgical RS-5035
Type 1 Collagenase Gibco 17100017
Water Bath Fisher Scientific 15-462-10
Whatman Grade 1 Filter Paper Whatman 1001-110

References

  1. Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. . Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
  2. Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
  3. Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
  4. Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
  5. Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
  6. Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
  7. Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
  8. Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
  9. Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
  10. . Corning Cell Counter Demo Video Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022)
  11. Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
  12. Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
  13. Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
  14. Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. . Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).
  15. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
  16. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
  17. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
  18. Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
  19. Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
  20. Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
  21. Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).

Play Video

Cite This Article
Kim, M., Jung, U., Shepherd, E., Mihelic, R., Voy, B. H. Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos. J. Vis. Exp. (186), e63861, doi:10.3791/63861 (2022).

View Video