Aislamiento de preadipocitos de embriones de pollos de engorde
Summary
El presente protocolo describe un método simple para aislar preadipocitos del tejido adiposo en embriones de pollos de engorde. Este método permite el aislamiento con alto rendimiento, cultivo primario y diferenciación adipogénica de preadipocitos. La tinción de aceite Rojo O y la tinción de lípidos /ADN midieron la capacidad adipogénica de las células aisladas inducidas con medios de diferenciación.
Abstract
Los preadipocitos primarios son un valioso sistema experimental para comprender las vías moleculares que controlan la diferenciación y el metabolismo de los adipocitos. Los embriones de pollo brindan la oportunidad de aislar los preadipocitos desde la etapa más temprana del desarrollo adiposo. Esta célula primaria se puede utilizar para identificar factores que influyen en la proliferación de preadipocitos y la diferenciación adipogénica, lo que los convierte en un modelo valioso para estudios relacionados con la obesidad infantil y el control del exceso de deposición de grasa en aves de corral. El rápido crecimiento del tejido adiposo postnatal desperdicia efectivamente el alimento al asignarlo lejos del crecimiento muscular en pollos de engorde. Por lo tanto, los métodos para comprender las primeras etapas del desarrollo del tejido adiposo pueden proporcionar pistas para regular esta tendencia e identificar formas de limitar la expansión adiposa temprano en la vida. El presente estudio fue diseñado para desarrollar un método eficiente para el aislamiento, el cultivo primario y la diferenciación adipogénica de preadipocitos aislados del tejido adiposo en desarrollo de embriones comerciales de pollos de engorde (tipo carne). El procedimiento se ha optimizado para producir células con alta viabilidad (~ 98%) y una mayor capacidad para diferenciarse en adipocitos maduros. Este método simple de aislamiento, cultivo y diferenciación de preadipocitos embrionarios apoya los análisis funcionales del crecimiento y desarrollo de la grasa en los primeros años de vida.
Introduction
La obesidad es una amenaza para la salud mundial tanto para adultos como para niños. Los niños con sobrepeso u obesidad tienen aproximadamente cinco veces más probabilidades de ser obesos como adultos, lo que los coloca en un riesgo significativamente mayor de enfermedad cardiovascular, diabetes y muchas otras comorbilidades. Alrededor del 13.4% de los niños estadounidenses de 2 a 5 años de edad tienen obesidad1, lo que ilustra que la tendencia a acumular exceso de grasa corporal puede ponerse en marcha muy temprano en la vida. Por razones muy diferentes, la acumulación de exceso de tejido adiposo es una preocupación para los pollos de engorde (tipo carne). Los pollos de engorde modernos son increíblemente eficientes, pero aún acumulan más lípidos de lo fisiológicamente necesario 2,3. Esta tendencia comienza poco después de la eclosión y efectivamente desperdicia el alimento, el componente de producción más caro, al asignarlo lejos del crecimiento muscular. Por lo tanto, tanto para los niños como para los pollos de engorde, aunque por razones muy diferentes, existe la necesidad de comprender los factores que influyen en el desarrollo del tejido adiposo e identificar formas de limitar la expansión adiposa temprano en la vida.
Los adipocitos se forman a partir de preadipocitos, células madre derivadas del tejido adiposo que se someten a diferenciación para desarrollar células grasas maduras que almacenan lípidos. En consecuencia, los preadipocitos in vitro son un modelo experimental valioso para los estudios de obesidad. Estas células, aisladas de la fracción vascular estromal de los depósitos adiposos, pueden proporcionar una comprensión fundamental de las vías moleculares que controlan la diferenciación y el metabolismo de los adipocitos 4,5. Los embriones de pollitos son un modelo experimental favorable en los estudios de desarrollo porque cultivar óvulos en el horario deseado facilita la manipulación experimental, ya que permite obtener embriones sin el sacrificio de la madre para observar una serie de etapas de desarrollo de los embriones. Además, no se requieren procedimientos quirúrgicos complicados y largos períodos de tiempo para obtener embriones en relación con modelos animales más grandes. Por lo tanto, el embrión de pollito presenta una oportunidad para obtener preadipocitos desde las primeras etapas del desarrollo del tejido adiposo. El tejido adiposo subcutáneo se hace visible en el pollito alrededor del día embrionario 12 (E12) como un depósito claramente definido ubicado alrededor del muslo. Este depósito está enriquecido en preadipocitos altamente proliferativos que se diferencian activamente bajo señales de desarrollo para formar adipocitos maduros 6,7. El proceso de diferenciación adipogénica es comparable entre pollos y humanos. Por lo tanto, los preadipocitos aislados de embriones de pollo se pueden utilizar como un modelo de doble propósito para estudios relevantes para humanos y aves de corral. Sin embargo, el rendimiento de los preadipocitos disminuye con el envejecimiento a medida que las células crecen en adipocitos maduros5.
El presente protocolo optimiza el aislamiento de los preadipocitos del tejido adiposo durante la etapa (E16-E18) en la que la diferenciación adipogénica y la hipertrofia de los adipocitos están en su punto máximo en embriones de pollos de engorde8. Este procedimiento puede evaluar los efectos de los factores a los que el embrión en desarrollo está expuesto in ovo, como la dieta de la gallina, sobre el desarrollo de los adipocitos y el potencial adipogénico ex vivo. También puede probar el impacto de varias manipulaciones (por ejemplo, hipoxia, adiciones de nutrientes, agonistas farmacológicos y antagonistas) en la adipogénesis o en los diversos ‘omes( por ejemplo, transcriptoma, metaboloma, metiloma) de los progenitores de adipocitos. Como representación de la etapa más temprana de la formación adiposa, las células obtenidas utilizando este protocolo son modelos valiosos para estudios relevantes para aves de corral y humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque varios protocolos bien descritos han reportado el aislamiento de preadipocitos 14,15,16,17, se ha optimizado el aislamiento para preadipocitos embrionarios, que pueden usarse para análisis funcionales del crecimiento y desarrollo de grasa en la vida temprana en pollitos de engorde. Este protocolo produce progenitores de adipocitos embrionarios de alta viabilidad con alto potencial de di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a UT AgResearch y al Departamento de Ciencia Animal por apoyar y optimizar este protocolo. Este trabajo fue financiado por una subvención del USDA.
Materials
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | Evos | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
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