Isolering av aktiv caenorhabditt elegans kjernefysisk ekstrakt og rekonstituering for in vitro transkripsjon

Den lille, frittlevende nematoden Caenorhabditis elegans er en enkel, men kraftig modellorganisme for å adressere et bredt spekter av biologiske spørsmål. Siden introduksjonen i 1963 har nematodene vært uvurderlige for å svare på spørsmål innen nevrobiologi, metabolisme, aldring, utvikling, immunitet og ^genetikk1. Noen av dyrets mange egenskaper som gjør det til en ideell modellorganisme inkluderer kort generasjonstid, effektiviteten av RNA-interferens, gjennomsiktig kropp og de ferdige kartene over både cellulær avstamning og nervesystem.

Mens nematodens bidrag til vitenskapen er enorme, har de blitt underbrukt for å belyse det eukaryote transkripsjonssystemet, med det meste av vår forståelse om disse mekanismene som kommer fra studier som bruker atomekstrakt fra gjær, fruktflue og ^{pattedyrcellekultur2}. Det største hinderet som fraråder forskere å trekke ut funksjonell atomekstrakt er nematodens tøffe ytre kutikal. Dette eksoskjelettet består av krysskoblede kollagener, cuticlins, glykoproteiner og lipider, noe som gjør C. elegans fra larvalstadium til voksen alder motstandsdyktig mot proteinutvinning via kjemiske eller mekaniske ^krefter3. Et in vitro transkripsjonssystem ved hjelp av C. elegans kjernefysisk ekstrakt ble en gang utviklet, men ikke allment vedtatt på grunn av systemets begrensede omfang, og bruken av Dounce homogenisator for å forberede ekstraktet kan føre til protein ^{ustabilitet4,5}.

I motsetning til den forrige protokollen for kjernefysisk ekstraktisolasjon som brukte en Dounce homogenisator for å bryte C. elegans, bruker denne protokollen en Balch homogenisator. Balch homogenisator består av to hovedkomponenter: en wolframkarbidkule og en blokk i rustfritt stål med en kanal som kjeder seg gjennom fra den ene enden til den andre. Balch homogenisator er lastet med wolframkarbidkulen og avkortet på hver side for å forsegle slipekammeret. Sprøyter kan lastes på de to vertikale portene som fører inn i slipekammeret. Når materialet overføres fra den ene sprøyten til den andre gjennom slipekammeret, tvinger trykket fra sprøytene materialet gjennom et smalt gap mellom ballen og veggen av kammeret. Dette langsomme og konstante trykket bryter materialet til det når en konsistent størrelse som lett kan passere gjennom det smale gapet. Å tvinge C. elegans gjennom det smale gapet via et konstant, men mildt trykk bryter dyrene åpne, og frigjør innholdet i den omkringliggende bufferen. Veksling av kulestørrelser strammer gapet ytterligere, bryter de nylig utgitte cellene og frigjør kjernene i bufferen. Flere tilfeller av sentrifugering skiller kjernene fra resten av celleavfallet, noe som muliggjør innsamling av et rent atomekstrakt. Balch homogenisator er foretrukket fremfor Dounce homogenisator av flere grunner: systemet kan håndtere et stort antall dyr, noe som gjør det mulig å trekke ut en høy mengde aktive proteiner i et enkelt forsøk; den nøyaktige maskineringen av ballene og stålblokken gir konsistent sliping mellom flere prøver; Den tunge stålblokken fungerer som en kjøleribbe, og trekker ensartet varme bort fra slipekammeret, og forhindrer denaturering.

Etter isolasjon må den kjernefysiske ekstrakttranskripsjonsaktiviteten verifiseres før den brukes i biokjemiske eksperimenter. Tradisjonelt ble transkripsjonsaktivitet målt ved hjelp av radiomerkede nukleotider for å spore og visualisere den nylig syntetiserte RNA. Radioaktiv merking kan imidlertid være belastende, da det krever forsiktighet under bruk og ^avhending6. Teknologiske fremskritt gjør det mulig for forskere i dag å bruke mye mindre skadelige eller plagsomme metoder for å måle selv små RNA-mengder ved hjelp av teknikker som kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR)⁷. Her beskriver protokollen en metode for å isolere aktivt kjernefysisk ekstrakt fra larvaltrinn 4 (L4) C. elegans og visualisere transkripsjonsaktivitet i et in vitro-system.