Summary

Isolamento dell'estratto nucleare attivo di Caenorhabditis elegans e ricostituzione per la trascrizione in vitro

Published: August 11, 2021
doi:

Summary

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare l’estratto nucleare attivo dallo stadio larvale 4 C. elegans e visualizzare l’attività di trascrizione in un sistema in vitro .

Abstract

Caenorhabditis elegans è stato un importante sistema modello per la ricerca biologica da quando è stato introdotto nel 1963. Tuttavia, C. elegans non è stato pienamente utilizzato nello studio biochimico delle reazioni biologiche utilizzando i suoi estratti nucleari come la trascrizione in vitro e la replicazione del DNA. Un ostacolo significativo per l’uso di C. elegans negli studi biochimici è interrompere la spessa cuticola esterna del nematode senza sacrificare l’attività dell’estratto nucleare. Mentre diversi metodi sono usati per rompere la cuticola, come l’omogeneizzazione di Dounce o la sonicazione, spesso portano all’instabilità delle proteine. Non esistono protocolli stabiliti per isolare proteine nucleari attive da larve o C. elegans adulti per reazioni in vitro . Qui, il protocollo descrive in dettaglio l’omogeneizzazione dello stadio larvale 4 C. elegans utilizzando un omogeneizzatore Balch. L’omogeneizzatore Balch utilizza la pressione per forzare lentamente gli animali attraverso uno stretto spazio che rompe la cuticola nel processo. Il design uniforme e la lavorazione precisa dell’omogeneizzatore Balch consentono una rettifica costante degli animali tra gli esperimenti. Il frazionamento dell’omogeneizzatore ottenuto dall’omogeneizzatore di Balch produce un estratto nucleare funzionalmente attivo che può essere utilizzato in un metodo in vitro per l’analisi dell’attività di trascrizione di C. elegans.

Introduction

Il piccolo nematode caenorhabditis elegans è un organismo modello semplice ma potente per affrontare una vasta gamma di questioni biologiche. Fin dalla sua introduzione nel 1963, i nematodi sono stati preziosi per rispondere a domande di neurobiologia, metabolismo, invecchiamento, sviluppo, immunità e genetica1. Alcune delle molte caratteristiche dell’animale che lo rendono un organismo modello ideale includono il breve tempo di generazione, l’efficacia dell’interferenza dell’RNA, il corpo trasparente e le mappe completate sia del suo lignaggio cellulare che del sistema nervoso.

Mentre i contributi del nematode alla scienza sono vasti, sono stati sottoutilizzati per chiarire il sistema di trascrizione eucariotica, con la maggior parte della nostra comprensione di questi meccanismi proveniente da studi che utilizzano estratto nucleare da lievito, moscerino della frutta e coltura cellulare di mammiferi2. Il più grande ostacolo che dissuade i ricercatori dall’estrarre l’estratto nucleare funzionale è la cuticola esterna dura del nematode. Questo esoscheletro comprende collageni reticolati, cuticlini, glicoproteine e lipidi, rendendo C. elegans dallo stadio larvale all’età adulta resistente all’estrazione di proteine attraverso forze chimiche o meccaniche3. Un sistema di trascrizione in vitro che utilizza l’estratto nucleare di C. elegans è stato sviluppato una volta, ma non ampiamente adottato a causa della portata limitata del sistema, e l’uso dell’omogeneizzatore Dounce per preparare l’estratto potrebbe portare all’instabilità proteica4,5.

A differenza del precedente protocollo per l’isolamento dell’estratto nucleare che utilizzava un omogeneizzatore Dounce per rompere C. elegans, questo protocollo utilizza un omogeneizzatore Balch. L’omogeneizzatore Balch è costituito da due componenti principali: una sfera in carburo di tungsteno e un blocco in acciaio inossidabile con un canale forato da un’estremità all’altra. L’omogeneizzatore Balch viene caricato con la sfera in carburo di tungsteno e tappato su entrambi i lati per sigillare la camera di macinazione. Le siringhe possono essere caricate sulle due porte verticali che conducono nella camera di rettifica. Quando il materiale viene fatto passare da una siringa all’altra attraverso la camera di macinazione, la pressione delle siringhe forza il materiale attraverso uno stretto spazio tra la sfera e la parete della camera. Questa pressione lenta e costante rompe il materiale fino a raggiungere una dimensione costante che è in grado di passare facilmente attraverso lo stretto spazio. Forzare C. elegans attraverso lo stretto spazio attraverso una pressione costante ma delicata rompe gli animali aperti, rilasciando il loro contenuto nel buffer circostante. La commutazione delle dimensioni della sfera stringe ulteriormente lo spazio, rompendo le cellule appena rilasciate e liberando i nuclei nel buffer. Più istanze di centrifugazione separano i nuclei dal resto dei detriti cellulari, consentendo la raccolta di un estratto nucleare pulito. L’omogeneizzatore Balch è preferito all’omogeneizzatore Dounce per diversi motivi: il sistema può gestire un gran numero di animali, rendendo possibile l’estrazione di un’elevata quantità di proteine attive in un solo tentativo; la lavorazione precisa delle sfere e del blocco di acciaio consente una rettifica costante tra più campioni; il pesante blocco di acciaio funge da dissipatore di calore, allontanando uniformemente il calore dalla camera di macinazione, prevenendo la denaturazione.

Dopo l’isolamento, l’attività trascrizionale dell’estratto nucleare deve essere verificata prima di essere utilizzata in qualsiasi esperimento biochimico. Tradizionalmente, l’attività di trascrizione è stata misurata utilizzando nucleotidi radiomarcati per tracciare e visualizzare l’RNA appena sintetizzato. Tuttavia, l’etichettatura radioattiva può essere onerosa in quanto richiede precauzioni durante l’uso e lo smaltimento6. I progressi tecnologici consentono oggi ai ricercatori di utilizzare metodi molto meno dannosi o fastidiosi per misurare anche piccole quantità di RNA utilizzando tecniche come la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)7. Qui, il protocollo descrive un metodo per isolare l’estratto nucleare attivo dallo stadio larvale 4 (L4) C. elegans e visualizzare l’attività di trascrizione in un sistema in vitro.

Protocol

1. Preparazioni dei media Preparare piastre di agar sterili in brodo di lisogenesi (LB) e fluidi liquidi seguendo le istruzioni del produttore. Striscia Escherichia coli (E. coli) ceppo OP50 su una piastra di agar LB. Incubare la striscia batterica a 37 °C durante la notte. Conservare la piastra striata di E. coli OP50 a 4 °C dopo l’incubazione. La piastra E. coli OP50 può essere conservata in modo sicuro a 4 °C per 2 settimane se avvolta in parafilm p…

Representative Results

Seguendo i passaggi delineati dovrebbe produrre estratto nucleare funzionale (Figura 1), la deviazione nelle fasi di macinazione o lavaggio può portare a scarsa attività o bassi rendimenti. Se si ottiene un estratto nucleare funzionale di C. elegans , trascriverà la regione a valle del promotore CMV sul modello di DNA quando aggiunto al test in vitro precedentemente descritto. Il trascritto di RNA risultante può essere purificato dalle …

Discussion

C. elegans è un organismo modello attraente per studiare il sistema di trascrizione eucariotica a causa del suo basso costo di manutenzione e della facilità di manipolazione genetica. Qui viene descritto un protocollo per l’isolamento coerente dell’estratto nucleare funzionalmente attivo da L4 C. elegans . Sebbene questo protocollo si concentrasse sulla visualizzazione dell’attività di trascrizione, il cDNA prodotto post-trascrizionalmente può essere quantificato utilizzando RT-qPCR per ottenere una…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione NIH MIRA (R35GM124678 a J. S.).

Materials

Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear Genesee Scientific  24-706
0.2 mL Individual PCR tubes Genesee Scientific  24-153G
1.7 mL sterile microtubes Genesee Scientific 24-282S
100% absolute molecular grade ethanol Fisher Scientific  BP2818
100% ethanol, Koptec Decon Labs  V1001
10 mL serological pipet VWR international  89130-898
150 mm petri plates Tritech Research  T3325
15 mL conical centrifuge tubes Genesee Scientific  28-103
20 mL plastic syringes Fisher Scientific 14955460
2 mL Norm-Ject syringes Henke-Sass Wolf GmbH 4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus Millipore Sigma SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes ThermoFisher Scientific 339652
50 mL serological pipet VWR international  89130-902
5 mL serological pipet VWR international  89130-896
Agar, Criterion VWR International  C7432
Agarose Denville Scientific  CA3510-6
Alcohol proof marker VWR International  52877-310
Bacto peptone VWR International  90000-264
Caenorhabditis elegans CGC N2
Calcium dichloride Millipore Sigma  C4901
Cholesterol Millipore Sigma  C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol Invitrogen  15508-013
DNA gel stain, SYBR safe Invitrogen  S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler Fisher Scientific  SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack Fisher Scientific  FERR1161
DNase, Baseline-ZERO Lucigen  DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain CGC OP50
Glacial acetic acid Fisher Scientific  A38
Glycerol Millipore Sigma  G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe Promega  E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco Millipore Sigma 15630080
Hydrochloric acid 37% Millipore Sigma  P0662
Hypochlorite bleach Clorox
LB Broth Millipore Sigma  L3022
Magnesium dichloride Millipore Sigma  M8266
Magnesium Sulfate Millipore Sigma  M7506
Medium weigh dishes Fisher Scientific  02-202-101
microscope slides, Vista vision VWR International 16004-368
molecular grade water, Hypure Hyclone Laboratories  SH30538
Nystatin Millipore Sigma  N1638
PCR system, FailSafe with premix A Lucigen  FS99100
Potassium chloride Millipore Sigma  P39111
Potassium phosphate dibasic Millipore Sigma  P3786
Potassium phosphate monobasic Millipore Sigma  P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x ThermoFisher Scientific 78430
protein assay kit, Qubit ThermoFisher Scientific  Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript Qiagen 205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit Qiagen 74004
RNase Inhibitor Applied Biosystems  N8080119
Sodium Chloride VWR International  BDH9286-12KG
Sodium hydroxide Millipore Sigma  1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane VWR international 28145-501
Sucrose VWR International  200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base Fisher Scientific  BP152
Tween20 Millipore Sigma  P2287
Equipment
-20 °C incubator ThermoFisher Scientific
20 °C incubator ThermoFisher Scientific
37 °C incubator Forma Scientific
4 °C refrigerator ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer Eppendorf
Autoclave Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer Isobiotec
Benchtop Vortexer Fisher Scientific 2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R Eppendorf 5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50 VWR International 82013-800
Dissection microscope, Leica M80 Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0 Invitrogen Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500 ThermoFisher Scientific  A44241
Gel system ThermoFisher Scientific
Heat block VWR International 12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424 Eppendorf 22620401
PIPETBOY acu 2 Integra 155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS Rainin 17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS Rainin 17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS Rainin 17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS Rainin 17014392
Rocking platform VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro Eppendorf 950030010

References

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. 유전학. 200 (2), 387-407 (2015).
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  3. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).
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  8. Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system. BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).
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  10. Zbacnik, T. J., et al. Role of buffers in protein formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).

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Cite This Article
Wibisono, P., Sun, J. Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription. J. Vis. Exp. (174), e62723, doi:10.3791/62723 (2021).

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