생체외 전사에 대한 활성 Caenorhabditis elegans 핵 추출물 및 재구성의 고립
Summary
여기서는 애벌레 4C. 예르간 에서 활성 핵 추출물을 분리하고 체외 시스템에서 전사 활동을 시각화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
Caenorhabditis elegans는 1963년에 도입된 이래 생물학 연구를 위한 중요한 모형 시스템이었습니다. 그러나, C. elegans는 체외 전사 및 DNA 복제와 같은 핵 추출물을 사용하여 생물학적 반응의 생화학 연구에서 완전히 활용되지 않았습니다. 생화학 연구에서 C. elegans를 사용 하 여 중요 한 장애물은 핵 추출 물의 활동을 희생 하지 않고 선충의 두꺼운 외부 큐 티 클을 방해. 여러 가지 방법은 Dounce 균질화 또는 초음파 처리와 같은 표피를 깨는 데 사용되지만 종종 단백질 불안정으로 이어질 수 있습니다. 체외 반응에 대한 애벌레 또는 성인 C. elegans에서 활성 핵 단백질을 격리하기위한 확립 된 프로토콜이 없습니다. 여기서, 프로토콜은 발치 균질화제를 사용하여 애벌레 단계 4 C. elegans의 균질화를 자세히 설명합니다. 발치 균질화는 압력을 사용하여 동물을 천천히 좁은 틈새를 통해 동물을 강제로 밀어 내어 그 과정에서 큐티클을 깨뜨린다. 발치 균질화제의 균일한 디자인과 정밀한 가공은 실험 사이에 동물의 일관된 분쇄를 가능하게 합니다. 발치 균질화로부터 얻은 균질화는 C. 예르건의 전사 활성을 속이는 시험관 내 방법으로 사용될 수 있는 기능적으로 활성 핵 추출물을 산출한다.
Introduction
작고 자유로운 선충 인 Caenorhabditis elegans 는 광범위한 생물학적 질문을 해결하기위한 간단하면서도 강력한 모델 유기체입니다. 1963년에 도입된 이래, 선충은 신경생물학, 신진대사, 노화, 발달, 면역 및 유전학1에 있는 질문에 대답하는 데 귀중했습니다. 이상적인 모델 유기체를 만드는 동물의 많은 특성 중 일부는 짧은 세대 시간, RNA 간섭의 효과, 투명한 신체 및 세포 혈통과 신경계 의 완성 된지도를 포함합니다.
과학에 대한 선충의 기여는 광대하지만, 그들은 효모, 과일 파리 및 포유류 세포 배양2에서 핵 추출물을 사용하여 연구에서 오는 이러한 메커니즘에 대한 우리의 이해의 대부분과 함께, 진핵 전사 시스템을 해명하기 위해 활용되었습니다. 기능성 핵 추출물추출에서 연구원을 설득하는 가장 큰 장애물은 선충의 거친 외부 표피입니다. 이 외골격은 교차 연결된 콜라겐, 큐티클린, 당단백질 및 지질을 포함하며, 화학적 또는 기계적 힘을 통한 단백질 추출에 내성이 있는 성년기에 이르기까지 C. 엘레간을 만듭니다3. C. elegans 핵 추출물을 이용한 체외 전사 시스템은 한때 개발되었지만 시스템의 제한된 범위로 인해 널리 채택되지 않았으며, 추출물을 준비하기 위한 두스균제의 사용은 단백질 불안정성으로 이어질 수 있다4,5.
C. elegans를 깨기 위해 Dounce 균질화제를 활용한 핵 추출물 격리를 위한 이전 프로토콜과 달리 이 프로토콜은 발치 균질화제를 사용합니다. 발치 균질화는 텅스텐 초경 공과 한쪽 끝에서 다른 끝까지 지루하게 채널이있는 스테인레스 스틸 블록의 두 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다. 발치 균질화는 텅스텐 초경 공으로 로드되고 분쇄 챔버를 밀봉하기 위해 양쪽에 덮여있다. 주사기는 연삭 챔버로 이어지는 두 개의 수직 포트에 로드할 수 있습니다. 재료가 분쇄 챔버를 통해 다른 주사기에서 다른 주사기에서 전달될 때, 주사기의 압력은 공과 챔버의 벽 사이의 좁은 간격을 통해 재료를 강제로. 이 느리고 일정한 압력은 좁은 틈새를 쉽게 통과할 수 있는 일관된 크기에 도달할 때까지 재료를 분해합니다. 일정한 압력을 통해 좁은 간격을 통해 C. elegans를 강제로 동물을 열어, 주변 버퍼로 자신의 내용을 해제. 볼 크기를 전환하면 간격이 더욱 강화되어 새로 방출된 세포를 깨고 핵을 완충제로 풀어 놓습니다. 원심분리의 여러 인스턴스는 핵을 세포 잔해의 나머지 부분과 분리하여 깨끗한 핵 추출물의 수집을 허용합니다. 발치 균질화는 여러 가지 이유로 Dounce 균질화보다 선호됩니다 : 시스템은 한 번의 시도에서 높은 양의 활성 단백질을 추출 할 수 있도록 많은 수의 동물을 처리 할 수 있습니다. 공과 강철 블록의 정확한 가공은 여러 샘플 사이의 일관된 연삭을 허용합니다. 무거운 강철 블록은 방열판 역할을하며 연삭 챔버에서 균일하게 열을 끌어 들여 데칭을 방지합니다.
격리 후, 핵 추출물 전사 활성은 생화학 적 실험에 사용되기 전에 검증되어야합니다. 전통적으로, 전사 활성은 방사성 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 측정하여 새로 합성된 RNA를 추적하고 시각화하였다. 그러나 방사성 라벨은 사용 및 폐기 시 예방 조치가 필요하기 때문에 부담스러울 수 있습니다6. 기술 발전은 오늘날 연구원들이 훨씬 덜 유해하거나 번거로운 방법을 사용하여 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)7과 같은 기술을 사용하여 소량의 RNA 양을 측정 할 수 있게합니다. 여기서, 프로토콜은 애벌레 단계 4 (L4) C. elegans 에서 활성 핵 추출물을 분리하고 체외 시스템에서 전사 활성을 시각화하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans 는 저비용 유지 보수와 유전 조작의 용이성 으로 인해 진핵 전사 시스템을 연구하는 매력적인 모델 유기체입니다. 여기서 L4 C. elegans 로부터 기능적으로 활성 핵 추출물의 일관된 절연을 위한 프로토콜이 설명된다. 이 프로토콜은 전사 활성을 시각화하는 데 초점을 맞추고 있지만, 전사 후 생성된 cDNA는 RT-qPCR을 사용하여 전사 활성8의 보다 정밀한 측정을 얻?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH MIRA 보조금 (J.S.에 R35GM124678)에 의해 지원되었다.
Materials
| Consumables and reagents | |||
| 0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear | Genesee Scientific | 24-706 | |
| 0.2 mL Individual PCR tubes | Genesee Scientific | 24-153G | |
| 1.7 mL sterile microtubes | Genesee Scientific | 24-282S | |
| 100% absolute molecular grade ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | |
| 100% ethanol, Koptec | Decon Labs | V1001 | |
| 10 mL serological pipet | VWR international | 89130-898 | |
| 150 mm petri plates | Tritech Research | T3325 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-103 | |
| 20 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14955460 | |
| 2 mL Norm-Ject syringes | Henke-Sass Wolf GmbH | 4020 | |
| 500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus | Millipore Sigma | SCGPU10RE | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50 mL serological pipet | VWR international | 89130-902 | |
| 5 mL serological pipet | VWR international | 89130-896 | |
| Agar, Criterion | VWR International | C7432 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Alcohol proof marker | VWR International | 52877-310 | |
| Bacto peptone | VWR International | 90000-264 | |
| Caenorhabditis elegans | CGC | N2 | |
| Calcium dichloride | Millipore Sigma | C4901 | |
| Cholesterol | Millipore Sigma | C8667 | |
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’ | |||
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’ | |||
| Deionized water | |||
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DNA gel stain, SYBR safe | Invitrogen | S33102 | |
| DNA ladder mix, O’gene ruler | Fisher Scientific | SM1173 | |
| DNA Loading Dye, 6x TriTrack | Fisher Scientific | FERR1161 | |
| DNase, Baseline-ZERO | Lucigen | DB0715K | |
| Dry ice | |||
| Escherichia coli OP50 strain | CGC | OP50 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G6279 | |
| HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe | Promega | E3110 | |
| Hepes Solution, 1 M Gibco | Millipore Sigma | 15630080 | |
| Hydrochloric acid 37% | Millipore Sigma | P0662 | |
| Hypochlorite bleach | Clorox | ||
| LB Broth | Millipore Sigma | L3022 | |
| Magnesium dichloride | Millipore Sigma | M8266 | |
| Magnesium Sulfate | Millipore Sigma | M7506 | |
| Medium weigh dishes | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| microscope slides, Vista vision | VWR International | 16004-368 | |
| molecular grade water, Hypure | Hyclone Laboratories | SH30538 | |
| Nystatin | Millipore Sigma | N1638 | |
| PCR system, FailSafe with premix A | Lucigen | FS99100 | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P39111 | |
| Potassium phosphate dibasic | Millipore Sigma | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P0662 | |
| Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| protein assay kit, Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33211 | |
| reverse transcription kit, Sensiscript | Qiagen | 205211 | |
| RNA extraction kit RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| RNase Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sodium Chloride | VWR International | BDH9286-12KG | |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | 1-09137 | |
| Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane | VWR international | 28145-501 | |
| Sucrose | VWR International | 200-334-9 | |
| transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’ | |||
| transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’ | |||
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 | |
| Equipment | |||
| -20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 37 °C incubator | Forma Scientific | ||
| 4 °C refrigerator | ThermoFisher Scientific | ||
| -80 °C freezer | Eppendorf | ||
| Autoclave | Sanyo | ||
| Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer | Isobiotec | ||
| Benchtop Vortexer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Centrifuge, Eppendorf 5418 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Centrifuge, VWR Clinical 50 | VWR International | 82013-800 | |
| Dissection microscope, Leica M80 | Leica Microsystems | ||
| Fluorometer, Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Gel imaging system, iBright FL1500 | ThermoFisher Scientific | A44241 | |
| Gel system | ThermoFisher Scientific | ||
| Heat block | VWR International | 12621-048 | |
| Microcentrifuges, Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620401 | |
| PIPETBOY acu 2 | Integra | 155017 | |
| Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014382 | |
| Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014388 | |
| Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014391 | |
| Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014392 | |
| Rocking platform | VWR International | ||
| Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro | Eppendorf | 950030010 |
References
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- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).
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- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Zbacnik, T. J., et al. Role of buffers in protein formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).
