Her beskriver vi en detaljert protokoll for å isolere aktivt atomekstrakt fra larvaltrinn 4 C. elegans og visualisere transkripsjonsaktivitet i et in vitro-system .
Caenorhabditis elegans har vært et viktig modellsystem for biologisk forskning siden det ble introdusert i 1963. Imidlertid har C. elegans ikke blitt fullt utnyttet i den biokjemiske studien av biologiske reaksjoner ved hjelp av sine kjernefysiske ekstrakter som in vitro transkripsjon og DNA-replikasjon. Et betydelig hinder for å bruke C. elegans i biokjemiske studier forstyrrer nematodens tykke ytre kutikal uten å ofre aktiviteten til atomekstraktet. Mens flere metoder brukes til å bryte kutiklet, for eksempel Dounce homogenisering eller sonikering, fører de ofte til protein ustabilitet. Det er ingen etablerte protokoller for å isolere aktive atomproteiner fra larve eller voksne C. elegans for in vitro-reaksjoner . Her beskriver protokollen i detalj homogeniseringen av larvetrinn 4 C. elegans ved hjelp av en Balch homogenisator. Balch homogenisator bruker trykk for å sakte tvinge dyrene gjennom et smalt gap som bryter kutiklet i prosessen. Den ensartede designen og presis maskinering av Balch homogenisator muliggjør konsekvent sliping av dyr mellom eksperimenter. Fraksjonering av homogenatet oppnådd fra Balch homogenisator gir funksjonelt aktiv kjernefysisk ekstrakt som kan brukes i en in vitro-metode for analyse av transkripsjonsaktivitet av C. elegans.
Den lille, frittlevende nematoden Caenorhabditis elegans er en enkel, men kraftig modellorganisme for å adressere et bredt spekter av biologiske spørsmål. Siden introduksjonen i 1963 har nematodene vært uvurderlige for å svare på spørsmål innen nevrobiologi, metabolisme, aldring, utvikling, immunitet og genetikk1. Noen av dyrets mange egenskaper som gjør det til en ideell modellorganisme inkluderer kort generasjonstid, effektiviteten av RNA-interferens, gjennomsiktig kropp og de ferdige kartene over både cellulær avstamning og nervesystem.
Mens nematodens bidrag til vitenskapen er enorme, har de blitt underbrukt for å belyse det eukaryote transkripsjonssystemet, med det meste av vår forståelse om disse mekanismene som kommer fra studier som bruker atomekstrakt fra gjær, fruktflue og pattedyrcellekultur2. Det største hinderet som fraråder forskere å trekke ut funksjonell atomekstrakt er nematodens tøffe ytre kutikal. Dette eksoskjelettet består av krysskoblede kollagener, cuticlins, glykoproteiner og lipider, noe som gjør C. elegans fra larvalstadium til voksen alder motstandsdyktig mot proteinutvinning via kjemiske eller mekaniske krefter3. Et in vitro transkripsjonssystem ved hjelp av C. elegans kjernefysisk ekstrakt ble en gang utviklet, men ikke allment vedtatt på grunn av systemets begrensede omfang, og bruken av Dounce homogenisator for å forberede ekstraktet kan føre til protein ustabilitet4,5.
I motsetning til den forrige protokollen for kjernefysisk ekstraktisolasjon som brukte en Dounce homogenisator for å bryte C. elegans, bruker denne protokollen en Balch homogenisator. Balch homogenisator består av to hovedkomponenter: en wolframkarbidkule og en blokk i rustfritt stål med en kanal som kjeder seg gjennom fra den ene enden til den andre. Balch homogenisator er lastet med wolframkarbidkulen og avkortet på hver side for å forsegle slipekammeret. Sprøyter kan lastes på de to vertikale portene som fører inn i slipekammeret. Når materialet overføres fra den ene sprøyten til den andre gjennom slipekammeret, tvinger trykket fra sprøytene materialet gjennom et smalt gap mellom ballen og veggen av kammeret. Dette langsomme og konstante trykket bryter materialet til det når en konsistent størrelse som lett kan passere gjennom det smale gapet. Å tvinge C. elegans gjennom det smale gapet via et konstant, men mildt trykk bryter dyrene åpne, og frigjør innholdet i den omkringliggende bufferen. Veksling av kulestørrelser strammer gapet ytterligere, bryter de nylig utgitte cellene og frigjør kjernene i bufferen. Flere tilfeller av sentrifugering skiller kjernene fra resten av celleavfallet, noe som muliggjør innsamling av et rent atomekstrakt. Balch homogenisator er foretrukket fremfor Dounce homogenisator av flere grunner: systemet kan håndtere et stort antall dyr, noe som gjør det mulig å trekke ut en høy mengde aktive proteiner i et enkelt forsøk; den nøyaktige maskineringen av ballene og stålblokken gir konsistent sliping mellom flere prøver; Den tunge stålblokken fungerer som en kjøleribbe, og trekker ensartet varme bort fra slipekammeret, og forhindrer denaturering.
Etter isolasjon må den kjernefysiske ekstrakttranskripsjonsaktiviteten verifiseres før den brukes i biokjemiske eksperimenter. Tradisjonelt ble transkripsjonsaktivitet målt ved hjelp av radiomerkede nukleotider for å spore og visualisere den nylig syntetiserte RNA. Radioaktiv merking kan imidlertid være belastende, da det krever forsiktighet under bruk og avhending6. Teknologiske fremskritt gjør det mulig for forskere i dag å bruke mye mindre skadelige eller plagsomme metoder for å måle selv små RNA-mengder ved hjelp av teknikker som kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR)7. Her beskriver protokollen en metode for å isolere aktivt kjernefysisk ekstrakt fra larvaltrinn 4 (L4) C. elegans og visualisere transkripsjonsaktivitet i et in vitro-system.
C. elegans er en tiltalende modellorganisme for å studere det eukaryote transkripsjonssystemet på grunn av det rimelige vedlikeholdet og den enkle genetiske manipulasjonen. Her beskrives en protokoll for konsekvent isolering av funksjonelt aktivt atomekstrakt fra L4 C. elegans . Selv om denne protokollen fokuserte på å visualisere transkripsjonsaktivitet, kan cDNA produsert etter transkripsjonsmessig kvantifiseres ved hjelp av RT-qPCR for å oppnå en mer presis måling av transkri…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et NIH MIRA-tilskudd (R35GM124678 til J. S.).
Consumables and reagents | |||
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear | Genesee Scientific | 24-706 | |
0.2 mL Individual PCR tubes | Genesee Scientific | 24-153G | |
1.7 mL sterile microtubes | Genesee Scientific | 24-282S | |
100% absolute molecular grade ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | |
100% ethanol, Koptec | Decon Labs | V1001 | |
10 mL serological pipet | VWR international | 89130-898 | |
150 mm petri plates | Tritech Research | T3325 | |
15 mL conical centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-103 | |
20 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14955460 | |
2 mL Norm-Ject syringes | Henke-Sass Wolf GmbH | 4020 | |
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus | Millipore Sigma | SCGPU10RE | |
50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
50 mL serological pipet | VWR international | 89130-902 | |
5 mL serological pipet | VWR international | 89130-896 | |
Agar, Criterion | VWR International | C7432 | |
Agarose | Denville Scientific | CA3510-6 | |
Alcohol proof marker | VWR International | 52877-310 | |
Bacto peptone | VWR International | 90000-264 | |
Caenorhabditis elegans | CGC | N2 | |
Calcium dichloride | Millipore Sigma | C4901 | |
Cholesterol | Millipore Sigma | C8667 | |
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’ | |||
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’ | |||
Deionized water | |||
Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
DNA gel stain, SYBR safe | Invitrogen | S33102 | |
DNA ladder mix, O’gene ruler | Fisher Scientific | SM1173 | |
DNA Loading Dye, 6x TriTrack | Fisher Scientific | FERR1161 | |
DNase, Baseline-ZERO | Lucigen | DB0715K | |
Dry ice | |||
Escherichia coli OP50 strain | CGC | OP50 | |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38 | |
Glycerol | Millipore Sigma | G6279 | |
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe | Promega | E3110 | |
Hepes Solution, 1 M Gibco | Millipore Sigma | 15630080 | |
Hydrochloric acid 37% | Millipore Sigma | P0662 | |
Hypochlorite bleach | Clorox | ||
LB Broth | Millipore Sigma | L3022 | |
Magnesium dichloride | Millipore Sigma | M8266 | |
Magnesium Sulfate | Millipore Sigma | M7506 | |
Medium weigh dishes | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
microscope slides, Vista vision | VWR International | 16004-368 | |
molecular grade water, Hypure | Hyclone Laboratories | SH30538 | |
Nystatin | Millipore Sigma | N1638 | |
PCR system, FailSafe with premix A | Lucigen | FS99100 | |
Potassium chloride | Millipore Sigma | P39111 | |
Potassium phosphate dibasic | Millipore Sigma | P3786 | |
Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P0662 | |
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
protein assay kit, Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33211 | |
reverse transcription kit, Sensiscript | Qiagen | 205211 | |
RNA extraction kit RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
RNase Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
Sodium Chloride | VWR International | BDH9286-12KG | |
Sodium hydroxide | Millipore Sigma | 1-09137 | |
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane | VWR international | 28145-501 | |
Sucrose | VWR International | 200-334-9 | |
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’ | |||
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’ | |||
Tris-Base | Fisher Scientific | BP152 | |
Tween20 | Millipore Sigma | P2287 | |
Equipment | |||
-20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
37 °C incubator | Forma Scientific | ||
4 °C refrigerator | ThermoFisher Scientific | ||
-80 °C freezer | Eppendorf | ||
Autoclave | Sanyo | ||
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer | Isobiotec | ||
Benchtop Vortexer | Fisher Scientific | 2215365 | |
Centrifuge, Eppendorf 5418 R | Eppendorf | 5401000013 | |
Centrifuge, VWR Clinical 50 | VWR International | 82013-800 | |
Dissection microscope, Leica M80 | Leica Microsystems | ||
Fluorometer, Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
Gel imaging system, iBright FL1500 | ThermoFisher Scientific | A44241 | |
Gel system | ThermoFisher Scientific | ||
Heat block | VWR International | 12621-048 | |
Microcentrifuges, Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620401 | |
PIPETBOY acu 2 | Integra | 155017 | |
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014382 | |
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014388 | |
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014391 | |
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014392 | |
Rocking platform | VWR International | ||
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro | Eppendorf | 950030010 |