In Vitro Wedge Slice Vorbereitung für Diemimitieren In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Die Beobachtung der Aktivität neuronaler Schaltkreise wird idealerweise mit nativen sensorischen Eingaben und Rückkopplungen sowie einer intakten Konnektivität zwischen Hirnregionen in vivo durchgeführt. Die Durchführung von Experimenten, die eine einzellige Auflösung der funktionalen Schaltkreise geben, ist jedoch immer noch durch technische Herausforderungen im intakten Gehirn begrenzt. Während in vivo extrazelluläre Elektrophysiologie oder Multiphotonen-Bildgebungsverfahren zur Untersuchung von Aktivitäten in intakten Nervensystemen eingesetzt werden können, bleibt die Interpretation, wie verschiedene Eingänge integrieren oder die subschwelligen synaptischen Eingänge zu messen, schwierig. In vivo Vollzellaufnahmen überwinden diese Einschränkungen, sind aber selbst in Leicht zugänglichen Hirnregionen anspruchsvoll. Technische Herausforderungen von Einzelzell-Auflösungsexperimenten werden in bestimmten Neuronenpopulationen, die sich tief im Gehirn befinden, oder in räumlich diffusen Populationen, die entweder genetische Werkzeuge zur Lokalisierung von Zellen in vivo (z. B. genetische Expression von Channelrhodopsin gepaart mit Optrode-Aufzeichnung) oder post-hoc-histochemische Identifizierung nach der Erfassung von Standortkennzeichnungen (z. B. mit neurotransmissionsspezifischen Markern) weiter verstärkt. Die medialen Olivocochlear-Neuronen, die sich diffus in der Nähe der ventralen Oberfläche des Hirnstamms befinden, leiden unter den oben genannten Einschränkungen¹, was den Zugang zu In-vivo-Experimenten extrem erschwert.

Gehirn-Scheiben (100-500 m Dicke) sind seit langem verwendet worden, um Gehirn-Schaltungen zu studieren, einschließlich auditive Hirnstamm Schaltung, wegen der physischen Segregation der verbundenen Neuronen, die in der gleichen Scheibe^enthaltensind 2^{,3,4,5,6,7,8,9}. Experimente mit viel dickeren Scheiben (>1 mm) wurden in anderen Labors eingesetzt, um zu verstehen, wie sich bilaterale Inputs in Bereichen des überlegenen Olivary-Komplexes (SOC) integrieren, einschließlich der medialen überlegenen Olive^10,11. Diese Scheiben wurden so hergestellt, dass Axone des Hörnervs (AN) innerhalb der Scheibe intakt blieben und elektrisch stimuliert wurden, um synaptische Neurotransmitter-Freisetzung in der CN zu initiieren, die Aktivität von Hörneuronen erster Ordnung imitiert, wie sie auf Schall reagieren würden. Ein großer Nachteil dieser dicken Scheiben ist die Sichtbarkeit von Neuronen für elektrophysiologische Aufnahmen mit Patch-Clamp (“Patching”). Patching wird immer schwieriger, da die zahlreichen Axone in diesem Bereich mit^12,13,14,15Myelinatiert werden, wodurch das Gewebe auch in einer typischen, dünnen Hirnscheibe optisch dicht und verdunkelt wird. Unser Ziel ist es, In-vitro-Präparate zu entwickeln, die eher der Schaltungskonnektivität von In-vivo-Aufnahmen ähneln, aber mit den hochdurchsatz- und hochauflösenden Aufnahmefähigkeiten der visuell geführten Patch-Clamp-Elektrophysiologie in Hirnscheiben.

Unser Labor untersucht die Physiologie von Neuronen des auditiven efferenten Systems, einschließlich MOC-Neuronen. Diese cholinergen Neuronen liefern efferent Essrücke an die Cochlea durch Modulation der Aktivität der äußeren Haarzellen (OHCs)^{16,17,18,19,20}. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Modulation eine Rolle bei der Gain-Kontrolle in der Cochlea^{21,22,23,24,25,26} und Schutz vor akustischen Trauma^{27,28,29,30,31,32,33}. Bei Mäusen befinden sich MOC-Neuronen diffus im ventralen Kern des Trapezkörpers (VNTB) im auditiven Hirnstamm¹. Unsere Gruppe hat die ChAT-IRES-Cre Mauslinie verwendet, die mit der tdTomato Reporter-Mauslinie gekreuzt wurde, um MOC-Neuronen in Hirnstammscheiben unter epifluoreszierender Beleuchtung anzuvisieren. Wir zeigten, dass MOC-Neuronen einen afferent hemmenden Input aus dem ipsilateralen Medialkern des Trapezkörpers (MNTB) erhalten, der wiederum durch Axone aus kugelförmigen Buschzellen (GBC) im kontralateralen Cochlea-Kern (CN)^{34,35,36,37,38}angeregt wird. Zusätzlich erhalten MOC-Neuronen wahrscheinlich ihren exzitatorischen Input von T-Stellatzellen im kontralateralen CN^39,40,41. Zusammengenommen zeigen diese Studien, dass MOC-Neuronen sowohl erregende als auch hemmende Eingaben erhalten, die vom gleichen (kontralateralen) Ohr abgeleitet werden. Jedoch, die präsynaptischen Neuronen, und ihre Axone konvergieren auf MOC Neuronen, sind nicht ganz nah genug aneinander, um vollständig intakt in einem typischen koronalen Scheibenpräparat zu sein. Um zu untersuchen, wie die Integration von synaptischen Inputs in MOC-Neuronen ihre Wirkungspotenziale beeinflusst, mit einem Fokus auf neu beschriebene Hemmung, entwickelten wir ein Präparat, bei dem wir die verschiedenen Afferents zu MOC-Neuronen von einem Ohr aus auf physiologisch realistische Weise stimulieren konnten, aber mit den technischen Vorteilen von In-vitro-Gehirnscheibenexperimenten.

Die Keilscheibe ist ein modifiziertes dickes Scheibenpräparat, das für die Untersuchung der Schaltungsintegration in MOC-Neuronen entwickelt wurde (schematisiert in Abbildung 1A). Auf der dicken Seite der Scheibe enthält der Keil die abgetrennten Axone des Hörnervs (nachfolgend “auditorische Nervenwurzel” genannt), wenn sie aus der Peripherie in das Hirnstamm gelangen und in der KN Synapsen synapsisch. Die auditive Nervenwurzel kann elektrisch stimuliert werden, um Neurotransmitter-Freisetzung und synaptische Aktivierung von Zellen der vollständig intakten CN^{42,43,44,45,46}zu evozieren. Dieses Stimulationsformat hat mehrere Vorteile für die Schaltungsanalyse. Erstens stimulieren wir die AN, anstatt die Initiativ- und GBC-Axone, die einen affeten Input in die MOC-Neuronen liefern, direkt zu stimulieren, um die Aktivierung von intrinsischen Schaltkreisen zu ermöglichen, die in der CN reichlich vorhanden sind. Diese Schaltkreise modulieren die Ausgabe von CN-Neuronen zu ihren Zielen im gesamten Gehirn, einschließlich MOC-Neuronen^{46,47,48,49,50,51}. Zweitens ermöglicht die polysynaptische Aktivierung von affemittenten Schaltkreisen vom AN über die CN vor dem CN von MOC-Neuronen ein natürlicheres Aktivierungs-Timing und eine Plastizität an diesen Synapsen, wie sie es in vivo während der auditiven Stimulation tun würden. Drittens können wir unsere Stimulationsmuster variieren, um AN-Aktivität nachzuahmen. Schließlich sind sowohl erregende als auch hemmende monaurale Projektionen auf MOC-Neuronen in der Keilscheibe intakt, und ihre Integration kann an einem MOC-Neuron mit der Präzision der Patch-Clamp-Elektrophysiologie gemessen werden. Insgesamt bietet dieses Aktivierungsschema einen intakteren Kreislauf zu den MOC-Neuronen im Vergleich zu einer typischen Gehirnscheibenpräparation. Diese Hirnstamm-Keilscheibe kann auch verwendet werden, um andere gehörive Bereiche zu untersuchen, die hemmende Inputs von ipsilateralem MNTB erhalten, einschließlich der lateralen überlegenen Olive, des überlegenen Olivary-Kerns und der medialen Superior Olive^{10,11,52,53,54,55,56}. Über unsere spezifische Präparation hinaus kann diese Schneidemethode verwendet oder modifiziert werden, um andere Systeme zu bewerten, mit den Vorteilen der Aufrechterhaltung der Konnektivität von Langzeiteingaben und der Verbesserung der Visualisierung von Neuronen für eine Vielzahl von einzelligen Elektrophysiologie- oder Bildgebungstechniken.

Dieses Protokoll erfordert die Verwendung einer Vibram-Stufe oder Plattform, die ca. 15° geneigt werden kann. Hier verwenden wir eine handelsübliche 2-teilige magnetische Bühne, bei der die “Bühne” eine Metallscheibe mit einem gekrümmten Boden in einer konkaven magnetischen “Bühnenbasis” ist. Die Bühne kann dann verschoben werden, um den Schnittwinkel anzupassen. Konzentrische Kreise auf der Bühnenbasis werden verwendet, um den Winkel reproduzierbar abzuschätzen. Die Bühnen- und Bühnenbasis befindet sich in der Schneidkammer, wo auch die magnetische Bühnenbasis gedreht werden kann.