In Vitro Wedge Slice Preparación para imitar la conectividad del circuito neuronal In Vivo

La observación de la actividad de los circuitos neuronales se realiza idealmente con entradas sensoriales nativas y retroalimentación, y conectividad intacta entre las regiones cerebrales, in vivo. Sin embargo, la realización de experimentos que dan resolución de una sola célula de la función del circuito neural todavía está limitada por desafíos técnicos en el cerebro intacto. Mientras que la electrofisiología extracelular in vivo o los métodos de imagen multifoton se pueden utilizar para investigar la actividad en sistemas nerviosos intactos, interpretar cómo diferentes entradas integran o miden las entradas sinápticas de subtrasinas sigue siendo difícil. Las grabaciones de células enteras in vivo superan estas limitaciones, pero son difíciles de realizar, incluso en regiones cerebrales a las que se puede acceder fácilmente. Los desafíos técnicos de los experimentos de resolución de una sola célula se amplifican aún más en ciertas poblaciones de neuronas que se encuentran en lo profundo del cerebro, o en poblaciones espacialmente difusas que requieren herramientas genéticas para localizar células in vivo (por ejemplo, expresión genética de channelrhodopsin emparejada con registro de optrode) o identificación histoquímica post-hoc después de registrar el etiquetado del sitio (por ejemplo, con marcadores específicos de la neurotransmisión). Al estar ubicadas difusamente cerca de la superficie ventral del tronco cerebral, las neuronas olivocochlear medial (MOC) sufren de las limitaciones anteriores^1,por lo que son extremadamente difíciles de acceder para la experimentación in vivo.

Las rebanadas cerebrales (espesor de 100-500 m) se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar los circuitos cerebrales, incluyendo circuitos auditivos de tronco encefálica, debido a la segregación física de las neuronas conectadas que se encuentran dentro de la misma rebanada^{2,3,4,5,6,7,8,9}. En otros laboratorios se han empleado experimentos con rodajas mucho más gruesas (>1 mm) para entender cómo se integran las entradas bilaterales en áreas del complejo olivar superior (SOC), incluyendo la aceituna superior medial^10,11. Estas rebanadas se prepararon de tal manera que los axones del nervio auditivo (AN) permanecieron intactos dentro de la rebanada y fueron estimulados eléctricamente para iniciar la liberación de neurotransmisores sinápticos en el CN, imitando la actividad de las neuronas auditivas de primer orden, ya que responderían al sonido. Una de las principales desventajas de estas rebanadas gruesas es la visibilidad de las neuronas para las grabaciones electrofisiológicas de la abrazadera de parches (“parcheing”). Parchear se vuelve cada vez más difícil a medida que los numerosos axones de esta zona se miinantican con^{edades de 12,13,14,15}años, haciendo que el tejido ópticamente denso y oscureciendo las neuronas incluso en una rebanada cerebral típica, delgada. Nuestro objetivo es crear preparaciones in vitro que se asemejen más a la conectividad de circuito de las grabaciones in vivo, pero con las capacidades de grabación de alto rendimiento y alta resolución de la electrofisiología de la abrazadera de parche guiada visualmente en las rebanadas cerebrales.

Nuestro laboratorio investiga la fisiología de las neuronas del sistema auditivo eferente, incluidas las neuronas MOC. Estas neuronas colinérgicas proporcionan una retroalimentación eferente a la cóclea modulando la actividad de las células pilosas externas (OHC)^{16,17,18,19,20}. Estudios previos han demostrado que esta modulación juega un papel en el control de ganancia en la cóclea^{21,22,23,24,25,26} y la protección contra el trauma acústico^{27,28,29,30,31,32,33}. En ratones, las neuronas MOC se encuentran difusamente en el núcleo ventral del cuerpo trapezoidal (VNTB) en el tronco cerebral auditivo^1. Nuestro grupo ha utilizado la línea de ratón ChAT-IRES-Cre cruzada con la línea de ratón reportero tdTomato para apuntar a las neuronas MOC en rebanadas de tronco cerebral bajo iluminación epifluorescente. Mostramos que las neuronas MOC reciben una aporte inhibitoria aferente del núcleo medial ipsilateral del cuerpo trapezoide (MNTB), que está excitado, a su vez, por axones de células tupidas globulares (GBC) en el núcleo coclear contralateral (CN)^34,35,36^,37,38. Además, las neuronas MOC probablemente reciben su entrada excitatoria de células T-estelares en el NC contralateral^39,40,41. En conjunto, estos estudios muestran que las neuronas MOC reciben insumos excitatorios e inhibitorios derivados del mismo oído (contralateral). Sin embargo, las neuronas presinápticas, y sus axones convergentes en las neuronas MOC, no están lo suficientemente cerca unas de otras para estar completamente intactas en una preparación típica de la rebanada coronal. Para investigar cómo la integración de las entradas sinápticas a las neuronas MOC afecta a sus patrones de disparo potencial de acción, con un enfoque en la inhibición recién descrita, desarrollamos una preparación en la que podríamos estimular los diversos aferentes a las neuronas MOC de un oído de la manera más realista fisiológicamente posible, pero con los beneficios técnicos de los experimentos in vitro de la división cerebral.

La rebanada de cuña es una preparación de rodaja gruesa modificada diseñada para la investigación de la integración de circuitos en neuronas MOC (esquemática en la Figura 1A). En el lado grueso de la rebanada, la cuña contiene los axones cortados del nervio auditivo (llamado “raíz nerviosa auditiva” en lo sucesivo) a medida que entran en el tronco encefálica desde la periferia y la sinapsis en el NC. La raíz nerviosa auditiva se puede estimular eléctricamente para evocar la liberación de neurotransmisores y la activación sináptica de las células de la CN⁴²completamente^{intacta,43,44,45,46}. Este formato de estimulación tiene varios beneficios para el análisis de circuitos. En primer lugar, en lugar de estimular directamente los axones T-estelar y GBC que proporcionan una entrada diferente a las neuronas MOC, estimulamos la AN para permitir la activación de circuitos intrínsecos abundantes en la NC. Estos circuitos modulan la salida de las neuronas CN a sus objetivos en todo el cerebro, incluyendo las neuronas MOC^{46,47,48,49,50,51}. En segundo lugar, la activación polisináptica de los circuitos aferentes desde el AN a través de la CN aguas arriba de las neuronas MOC permite un tiempo de activación más natural y que la plasticidad se produzca en estas sinapsis como lo harían in vivo durante la estimulación auditiva. En tercer lugar, podemos variar nuestros patrones de estimulación para imitar la actividad ano. Por último, las proyecciones monoaurales excitatorias e inhibitorias a las neuronas MOC están intactas en la rodaja de cuña, y su integración se puede medir en una neurona MOC con la precisión de la electrofisiología de la abrazadera de parche. En su conjunto, este esquema de activación proporciona un circuito más intacto a las neuronas MOC en comparación con una preparación típica de la rebanada cerebral. Esta rebanada de cuña de tronco encefálica también se puede utilizar para investigar otras áreas auditivas que reciben aporte inhibitorio de MNTB ipsilateral incluyendo la aceituna superior lateral, núcleo olivario superior y aceituna medial superior^{10,11,52,53,54,55,56}. Más allá de nuestra preparación específica, este método de corte se puede utilizar o modificar para evaluar otros sistemas con los beneficios de mantener la conectividad de entradas de largo alcance y mejorar la visualización de las neuronas para una variedad de electrofisiología de resolución de una sola célula o técnicas de imagen.

Este protocolo requiere el uso de una etapa vibratoria o una plataforma que se puede inclinar aproximadamente 15o. Aquí utilizamos una etapa magnética de 2 piezas disponible comercialmente donde la “etapa” es un disco de metal con un fondo curvo colocado en una “base de etapa” magnética cóncava. A continuación, se puede desplazar el escenario para ajustar el ángulo de corte. Los círculos concéntricos en la base del escenario se utilizan para estimar el ángulo de forma reproducible. La base de la etapa y la etapa se colocan en la cámara de corte, donde también se puede girar la base de la etapa magnética.