Summary

לימוד מכונה ללימוד למחצה של דנ א של מסחטות בפקאוסולפטיס

Published: June 18, 2020
doi:

Summary

במהלך מוות תאי הוא proinflammatory ותורם לדלקת. מדידת ecDNA באתר פציעה יכולה לקבוע את היעילות של הטיפול הטיפולי באיבר היעד. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בכלי למידה של מחשב כדי להפוך את המדידה של ecDNA ברקמת הכליות.

Abstract

מוות של תאים פקוניים הוא תכונה פתולוגית של myeloperoxidase אנטי נויטרופילים cytoplasmic נוגדן הקשורים דלקת כלי דם (MPO-AAV). חומצת מסחטות (ecDNA) שוחררה במהלך צורות שונות של מוות תאים, כולל אפופטוזיס, נמק, נקרופסיס, מלכודות נויטרופילים ופירופסיס. מדידה של מוות זה תא הוא זמן רב עם מספר סמנים שונים הנדרשים כדי לזהות את הצורות הביוכימי השונים של מוות תאים. מדידה של ecDNA מתנהל בדרך כלל סרום ושתן כמו פונדקאית עבור נזק לכליות, לא באיבר היעד בפועל שבו הפציעה הפתולוגית מתרחשת. הקושי הנוכחי בחקירת ecdna בכליה הוא חוסר שיטות עבור הרקמה הקבועה של פורמלין מוטבע רקמת פרפין (ffpe) הן בניסויים והן בארכיון ביופסיה של כליות האדם. פרוטוקול זה מספק סיכום של השלבים הדרושים לכתם עבור ecDNA ברקמת FFPE (הן של האדם וגם murine), כיבוי באופן אוטומטי ולמדוד את ecDNA בתמונות וכתוצאה מכך באמצעות כלי למידה מכונה מתוך הזמין בפומבי הקוד הפתוח הפנויה ImageJ תוסף trainable Weka פילוח. פילוח Trainable Weka מוחל על ecDNA בתוך הפקאולי היכן התוכנית לומדת לסווג ecDNA. מסווג זה מוחל על תמונות כליות שנרכשו לאחר מכן, ומפחית את הצורך ביאורים ידניים של כל תמונה בודדת. הסתגלות של פילוח Weka trainable מוצג עוד יותר ברקמת הכליות מפני הניסוי הנסיוני האנטי-MPO של מורלין (GN), כדי לזהות רשתות וecMPO, תורמים פתולוגיים שכיחים לאנטי MPO GN. שיטה זו מספקת ניתוח אובייקטיבי של ecDNA ברקמת כליות המדגימה בבירור את היעילות שבה trainable Weka התוכנית פילוח יכול להבחין ecDNA בין רקמת כליה נורמלית בריאה ורקמות הכליה החולה. ניתן להתאים בקלות פרוטוקול זה לזיהוי ecDNA, רשתות וecMPO באיברים אחרים.

Introduction

הנוגדן Myeloperoxidase אנטי נויטרופילים cytoplasmic הקשורים דלקת כלי דם (MPO-aav) היא מחלה אוטואימונית כי תוצאות אי ספיקת כליות מפציעה פתולוגית משמעותית עם מוות תאים משמעותי ושחרור של חומצה deoxyribonucleic (DNA)1,2. הדנ א יכול להפעיל את המערכת. החיסונית בכך שהוא מתפקד כאות סכנה בתנאים בריאים נורמליים, המיקום הגרעיני של דנ א מציע הגנה מפני חשיפה למערכת החיסונית. Self-DNA כי הוא שוחרר extracellularly במהלך תהליכים פתוגניים או חסינות אוטומטית נתפסת על ידי המערכת החיסונית כמו נזק proinflammatory הקשורים מולקולרית חלבון מולקולרי (לח)3. נוסף DNA הסלולר (ecdna) הוא שוחרר מן התאים המתים באמצעות מנגנונים ברורים מספר כי הם נשלטים על ידי מסלולים ביוכימיים ברורים, כגון אפופטוזיס, נקרופזה נויטרופילים מסחטות היווצרות המלכודת (רשתות), נמק או פירופסיס4,5,6,7,8.

אנו מתארים בזאת שיטות לכתם ולמדוד ecdna שוחרר מתאי מתים במקטעים של פורמלין קבוע פרפין מוטבע (ffpe) הכליות של ניסיוני anti-MPO GN וביופסיות כליות מחולים עם MPO-aav9,10. שיטות מרובות קיימות לזיהוי של במחזור dna תקועים כפול (dsdna) ו-dna מכלולי משני הסרום והשתן ומחוץ לחדר המבחנה11,12. שיטות אלה, למרות מדויק בקביעת כמות ecDNA, לא קובעים היכן ecDNA שוחרר מבחינה אנטומית. ישנן שיטות המתארות מדידה ספציפית של ecdna כגון tunel עבור אפופטוזיס ומדידה של פסולת תא13,14. אין שיטה המתארת מדידת ecDNA הגיע לשיאו מכל צורות של מוות תאים בכליות FFPE שבו הנזק הפתולוגי מתרחשת. חשוב לקבוע אם הטיפולים הטיפוליים הניסיוניים מרוקנים את ה-Dna מאתרי הפציעה הפתולוגית באיבר היעד הממשי.

רכישת תמונות מרובות מדגימות כליות יוצרת נפח גדול של נתונים שנותחו בדרך כלל על-ידי משתמש יחיד. זוהי עבודה אינטנסיבית, זמן רב והוא יכול להיות כפוף השגות מהימן על ידי משתמשים אחרים, עקב הטיית המשתמש. פילוח של Trainable weka הוא תוסף תוכנה לקוד פתוח עבור imagej המשתמש בכלים ביולוגיים מתקדמים כדי לסווג פיקסלים באמצעות אלגוריתמים15שללימוד מחשב 15,16. שיטה זו היא “trainable” לפיה היא לומדת מסיווג המשתמש של מקטעי פיקסלים ומחילה את הסיווג החדש למדו על תמונות אחרות. שיטה זו מסתמכת על כלי ניתוח נפוצים בתוך התוכנית ImageJ המשמשים “לסווג” כל פיקסל במקטע כשייכות ל”מחלקה” ספציפית. לאחר התוכנית לומדת את “מסווגים”, הם יכולים לשמש כדי לזהות קטעים מסווגים דומים אחרים בתוך אותה תמונה. מודל זה נשמר ומוחל על קבוצות אחרות של תמונות בתוך אותו ניסוי.

המכשולים הנוכחיים כדי לקבוע ecDNA בתוך מקטעי כליות הוא אוטודוגני אוטומטי מקיבעון בפורמאלין ואת ניתוח אינטנסיבית העבודה של התמונות. אנו מתארים כאן כיצד להרוות את זה autoפלואורסצנטית, לזהות ecDNA, ולהשתמש פיקוח מחשב למידה מדידה תפוקה גבוהה של ecDNA. פרסמנו בעבר את המדידה של רשתות ומMPO (ecMPO) באמצעות מאקרו ב-ImageJ, אנו מדגימים כעת למחצה אוטומציה של שיטות אלה באמצעות מחשב מפוקח למידה1. אנו מדגימים את ההסתגלות של כלי הלמידה של המכונה, כדי לסווג כתם חלופי לרשתות ו ecMPO בתוך אותה תמונה. אלה כתמים שיטות המתוארות כאן לגילוי ecdna, רשתות ו ecMPO ניתן לתרגם איברים מוצק אחרים ומחלות שבו ecdna, רשתות ו ecMPO משחק תפקיד להנציח את המחלה כגון דלקת מפרקים שגרונית ולופוס17,18.

Protocol

שיטה זו מאפשרת זיהוי של פאן ecDNA מכל צורות של מוות תאים. אותה שיטה ונוגדנים משמשים לרקמת ביופסיה של האדם (משלב 4). כל החיות והנושאים האנושיים היה אישור האתיקה מאוניברסיטת מונש, ומונש בריאות, קלייטון, ויקטוריה, אוסטרליה. 1. צביעת עבור ecDNA עם DAPI ו β-Actin לגרום 20 יום מודל של אנטי my…

Representative Results

תמונות אלה מייצגות את השלבים המרובים הדרושים כדי להשתמש בהצלחה פילוח Weka trainable כדי למזער את המדידה הידנית של העבודה אינטנסיבית של ecDNA ברקמת כליות FFPE ויטראז ‘ מתוך עכבר עם המושרה anti-MPO GN. שלבים אלה מסוכמים באיור 1 ובאיור 2 עם תמונות שצולמו ישיר?…

Discussion

פרוטוקולים מרובים קיימים כי למדוד סמנים proinflammatory בסרום ושתן של שני חולים ומודלים של העכבר של glomerulonephritis. הפרוטוקול המתואר מאפשר ניתוח של המוצרים של מוות תאים (ecDNA, רשתות ו-ecMPO) בתוך הפקולוס ישירות. הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם הכנת רקמות והדמיה. האלמנט העיקרי הגבלת שימוש בשיטת פלורס…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מכירים את מונש מיקרו הדמיה לשימוש של ניקון C1 זקוף לייזר מיקרוסקופ מערכת סריקה בלייזר ואת פלטפורמת מונש היסטולוגיה לעיבוד של רקמת כליה.

Materials

Bovine Serum Albumin SIGMA A2153 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.
Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-21468 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 ThermoFisher Scientific A-121468 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-21441 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken sera SIGMA C5405 Made up in 1%BSA/PBS
Coverslips 24 x60 mm Azerscientific ES0107222 #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy
EDTA 10mM SIGMA E6758 Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution
Ethanol 30%, 70% and 100% Chem Supply UN1170 Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water
Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) TRAJAN NBF-500 Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood
Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm TRAJAN J3800AM4 Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step
Goat anti human/mouse MPO antibody R&D AF3667 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Histosol Clini Pure CPL HISTOSOL 08 Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood
Hydrophobic pen VECTOR Labs H-400 Use to draw circle around kidney tissue
Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) ABCAM ab128086 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope Coherent Scientific Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Phosphate Buffered Saline SIGMA P38135 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time
Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless Tefal GSA-P2530738 Purchased at local homeware store
Prolong Gold DAPI Life Technologies P36962 Apply drops directly to coverslip
Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody ABCAM ab8227 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody ABCAM ab5103 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Staining rack 24 slides ProScitech H4465 Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven
Sudan Black B SIGMA 199664 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature
Tris 10mM SIGMA T4661 Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution
Xylene Trajan XL005/20 Must be use used in a fume hood

References

  1. O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  2. Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
  3. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
  6. Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
  7. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  8. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  9. Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
  10. Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
  11. Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
  12. Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
  13. Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
  14. Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
  15. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
  18. Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
  19. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  20. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  21. Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
  22. Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).

Play Video

Cite This Article
O’Sullivan, K. M., Creed, S., Gan, P., Holdsworth, S. R. Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis. J. Vis. Exp. (160), e61180, doi:10.3791/61180 (2020).

View Video