Aprendizado de Máquina Supervisionado para Semi-Quantificação de DNA Extracelular em Glomerulonephritis
Summary
O DNA extracelular (ecDNA) liberado durante a morte celular é proinflamatório e contribui para inflamação. A medição do ecDNA no local da lesão pode determinar a eficácia do tratamento terapêutico no órgão-alvo. Este protocolo descreve o uso de uma ferramenta de aprendizado de máquina para automatizar a medição do ecDNA no tecido renal.
Abstract
A morte celular glomerular é uma característica patológica do anticorpo citoplasmica anti-neutrófilo mielóperidase associado à vasculite (MPO-AAV). O ácido desoxiribonucleico extracelular (ecDNA) é liberado durante diferentes formas de morte celular, incluindo apoptose, necroptose, armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e pioptosis. A medição desta morte celular é demorada com vários biomarcadores diferentes necessários para identificar as diferentes formas bioquímicas de morte celular. A medição do ecDNA é geralmente conduzida em soro e urina como substituto para danos renais, não no órgão alvo real onde ocorre a lesão patológica. A dificuldade atual em investigar o ecDNA no rim é a falta de métodos para o tecido incorporado de parafina fixa formalina (FFPE) tanto experimentalmente quanto em biópsias renais humanas arquivadas. Este protocolo fornece um resumo das etapas necessárias para colorir para ecDNA no tecido FFPE (humano e murine), saciar a autofluorescência e medir o ecDNA nas imagens resultantes usando uma ferramenta de aprendizado de máquina da segmentação weka de código aberto disponível publicamente. A segmentação de Weka trainável é aplicada ao ecDNA dentro do glomeruli onde o programa aprende a classificar o ecDNA. Este classificador é aplicado a imagens renais adquiridas subsequentes, reduzindo a necessidade de anotações manuais de cada imagem individual. A adaptabilidade da segmentação de Weka trainável é demonstrada ainda mais no tecido renal a partir da glomerulonephrite murina experimental (GN), para identificar NETs e ecMPO, contribuintes patológicos comuns para o ANTI-MPO GN. Este método fornece uma análise objetiva da ecDNA no tecido renal que demonstra claramente a eficácia na qual o programa de segmentação de Weka pode distinguir o ECDNA entre tecido renal normal saudável e tecido renal doente. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para identificar ecDNA, NETs e ecMPO em outros órgãos.
Introduction
O anticorpo citoplasmico anti-neutrófilo associado à vasculite anti-neutronômica (MPO-AAV) é uma doença autoimune que resulta em insuficiência renal por lesão glomerular patológica com considerável morte celular e liberação de ácido desoxiribonucleico (DNA)1,,2. O DNA pode ativar o sistema imunológico agindo como um sinal de perigo. Em condições saudáveis normais, a localização nuclear do DNA oferece proteção contra a exposição ao sistema imunológico. O auto-DNA que é liberado extracelularmente durante processos patogênicos ou autoimunidade é visto pelo sistema imunológico como um potente dano proinflamatório associado à auto-proteína molecular (DAMP)3. O DNA celular extra (ecDNA) é liberado de células moribundas através de vários mecanismos distintos que são regidos por distintas vias bioquímicas, como apoptose, necroptose formação de armadilha extracelular (NETs), necrose ou pioptose4,,5,,6,,7,,8.
Descrevemos aqui métodos para colorar e medir o ecDNA liberado de células moribundas em seções de parafina fixa formalina incorporada (FFPE) de biópsias experimentais anti-MPO GN e renais de pacientes com MPO-AAV9,,10. Existem múltiplos métodos para a detecção de complexos de DNA duplo encalhado circulante (dsDNA) e DNA tanto do soro quanto da urina e dos ensaios in vitro11,12. Esses métodos, embora precisos na determinação da quantidade de ecDNA, não determinam onde o ecDNA é liberado anatomicamente. Existem métodos que descrevem a medição específica do ecDNA, como o tunel para apoptose e a medição de detritos celulares13,14. Não há nenhum método que descreva a medição do ECDNA culminado de todas as formas de morte celular nos rins FFPE onde ocorre o dano patológico. Isso é importante para determinar se os tratamentos terapêuticos experimentais estão eliminando o ecDNA dos locais de lesão patológica no órgão alvo real.
A aquisição de múltiplas imagens de amostras de rim cria um alto volume de dados que é analisado comumente por um único usuário. Isso é trabalhoso, demorado e pode estar sujeito a reprodutibilidade não confiável por outros usuários, devido ao viés do usuário. A segmentação de Weka é um plugin de software de código aberto para ImageJ que usa ferramentas bioinformáticas de ponta para classificar pixels usando algoritmos de aprendizado de máquina15,,16. Este método é “treinável” pelo qual aprende com a classificação do usuário segmentos de pixels e aplica a nova classificação aprendida a outras imagens. Este método se baseia em ferramentas de análise comuns dentro do programa ImageJ que são usadas para “classificar” cada pixel em um segmento como pertencente a uma “classe” específica. Uma vez que o programa aprende os “classificadores”, eles podem ser usados para identificar outros segmentos classificados semelhantes dentro da mesma imagem. Este modelo é então salvo e aplicado a outros conjuntos de imagens dentro do mesmo experimento.
Os obstáculos atuais para determinar o ecDNA in situ em seções renais é a autofluorescência endógena da fixação na formalina e a análise intensiva do trabalho intensivo das imagens. Descrevemos aqui como saciar essa autofluorescência, detectar ecDNA e usar aprendizado de máquina supervisionado para medição de alto rendimento do ecDNA. Publicamos anteriormente a medição de NETs e MPO extracelular (ecMPO) utilizando uma macro no ImageJ, agora demonstramos semimass automação desses métodos usando aprendizado de máquina supervisionado1. Demonstramos a adaptabilidade da ferramenta de aprendizado de máquina, para classificar uma mancha alternativa para NETs e ecMPO dentro da mesma imagem. Estes métodos de coloração descritos aqui para a detecção de ecDNA, NETs e ecMPO podem ser traduzidos para outros órgãos e doenças sólidas onde ecDNA, NETS e ecMPO desempenha um papel na perpetuação de doenças como artrite reumatoide e lúpus17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem protocolos múltiplos que medem marcadores proinflamatórios no soro e urina de ambos os pacientes e modelos de camundongos de glomerulonephritis. Este protocolo descrito permite a análise dos produtos de morte celular (ecDNA, NETs e ecMPO) dentro do glomerulus diretamente. Os passos mais cruciais neste protocolo são a preparação e a imagem do tecido. O principal elemento restritivo do uso de um método de coloração fluorescente para análise é a autofluorescência tecidual. O tecido de parafina fixa forma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos a Monash Micro Imaging pelo uso do microscópio de varredura a laser confocal Nikon C1 e da Plataforma de Histologia Monash para o processamento do tecido renal.
Materials
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
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