تحت إشراف التعلم الآلي من أجل تحديد شبه كمي للحمض النووي خارج الخلية في التهاب الجلوميرولونية
Summary
الحمض النووي خارج الخلية (ecDNA) صدر أثناء موت الخلايا هو proinflammatory ويساهم في التهاب. قياس ecDNA في موقع الإصابة يمكن تحديد فعالية العلاج العلاجي في الجهاز المستهدف. يصف هذا البروتوكول استخدام أداة التعلم الآلي لأتمتة قياس ecDNA في أنسجة الكلى.
Abstract
موت الخلايا الكبيبية هو سمة مرضية من النيولوبيروكسيديز المضادة للعدلات الأجسام المضادة السيتوبلازمية المرتبطة التهاب الأوعية الدموية (MPO-AAV). يتم تحرير حمض ديوكسيريبونوكليك (ecDNA) خارج الخلية (ecDNA) خلال أشكال مختلفة من موت الخلايا بما في ذلك موت الخلايا، نخر، نخر، العدلات الفخاخ خارج الخلية (NETs) و pyroptosis. قياس موت الخلية هذا يستغرق وقتا طويلا مع العديد من المؤشرات الحيوية المختلفة اللازمة لتحديد الأشكال الكيميائية الحيوية المختلفة لوفيات الخلايا. يتم قياس ecDNA بشكل عام في المصل والبول كبديل للتلف الكلوي ، وليس في الجهاز المستهدف الفعلي حيث تحدث الإصابة المرضية. الصعوبة الحالية في التحقيق ecDNA في الكلى هو عدم وجود طرق لinslyin الأنسجة المضمنة البرافين الثابتة (FFPE) على حد سواء تجريبيا وفي خزعات الكلى البشرية المؤرشفة. هذا البروتوكول يقدم ملخصا للخطوات المطلوبة لطخة ل ecDNA في أنسجة FFPE (كل من الإنسان و murine) ، وإخماد autofluorescence وقياس ecDNA في الصور الناتجة باستخدام أداة التعلم الآلي من المصدر المفتوح المتاح علنا ImageJ المساعد تدريب تجزئة Weka. يتم تطبيق تجزئة Weka القابلة للتدريب على ecDNA داخل الكبيات حيث يتعلم البرنامج تصنيف ecDNA. يتم تطبيق هذا المصنف على صور الكلى المكتسبة اللاحقة ، مما يقلل من الحاجة إلى التعليقات التوضيحية اليدوية لكل صورة على حدة. وقد ثبت أن القدرة على التكيف من تجزئة Weka القابلة للتدريب أكثر في أنسجة الكلى من التهاب الميرين التجريبي المضاد للكبيباتولونية (GN) ، لتحديد NETs وecMPO ، والمساهمين المرضية المشتركة لمكافحة MPO GN. توفر هذه الطريقة تحليلًا موضوعيًا لـ ecDNA في أنسجة الكلى يوضح بوضوح فعالية برنامج تجزئة Weka القابل للتدريب الذي يمكن أن يميز ecDNA بين أنسجة الكلى الطبيعية السليمة وأنسجة الكلى المريضة. ويمكن بسهولة تكييف هذا البروتوكول لتحديد ecDNA، NETs وecMPO في الأجهزة الأخرى.
Introduction
Myeloperoxidase المضادة للعدلات cytoplasmic الأجسام المضادة المرتبطة بهشاشة الأوعية الدموية (MPO-AAV) هو مرض المناعة الذاتية التي تؤدي إلى الفشل الكلوي من الإصابة الكبيبية المرضية مع موت الخلايا كبيرة وإطلاق حمض ديوكسي تريبونوكلليك (الحمض النووي)1,2. الحمض النووي يمكن تنشيط الجهاز المناعي من خلال العمل كإشارة الخطر. في ظل الظروف الصحية العادية، يوفر الموقع النووي للحمض النووي الحماية من التعرض للجهاز المناعي. الحمض النووي الذاتي الذي يتم تحريره خارج الخلية خلال العمليات المسببة للأمراض أو autoimmunity ينظر إليه من قبل الجهاز المناعي باعتباره الضرر proinflammatory قوية المرتبطة البروتين الذاتي الجزيئي (DAMP)3. يتم تحرير الحمض النووي الخلوي الإضافي (ecDNA) من الخلايا المحتضرة من خلال العديد من الآليات المتميزة التي تحكمها مسارات بيوكيميائية متميزة ، مثل المبرمج ، نخر العدلات العدلات تكوين فخ خارج الخلية (NETs) ، نخر أو pyroptosis4،5،6،,8.8
نحن وصف هنا أساليب لطخة وقياس ecDNA صدر من الخلايا المحتضرة في أقسام من البارافين ثابتة (FFPE) الكليتين من التجريبية المضادة MPO GN وخزعات الكلى من المرضى الذين يعانون من MPO-AAV9,10. توجد طرق متعددة للكشف عن تعميم الحمض النووي المزدوج (DsDNA) ومجمعات الحمض النووي من كل من المصل والبول ومن المختبرات11,12. هذه الطرق، على الرغم من دقة في تحديد كمية ecDNA، لا تحدد أين يتم تحرير ecDNA تشريحيا. هناك طرق تصف قياس محدد من ecDNA مثل موالف ل المبرمج وقياس حطام الخلية13،14. لا توجد طريقة تصف قياس ecDNA بلغت ذروتها من جميع أشكال موت الخلايا في الكلى FFPE حيث يحدث الضرر المرضي. وهذا أمر مهم لتحديد ما إذا كانت العلاجات العلاجية التجريبية وتطهير ecDNA من مواقع الإصابة المرضية في الجهاز المستهدف الفعلي.
إن الحصول على صور متعددة من عينات الكلى يخلق كمية كبيرة من البيانات التي يتم تحليلها بشكل شائع من قبل مستخدم واحد. هذا كثيف العمالة، تستغرق وقتا طويلا ويمكن أن تخضع لإعادة إنتاج لا يمكن الاعتماد عليها من قبل المستخدمين الآخرين، وذلك بسبب تحيز المستخدم. تجزئة Weka القابلة للتدريب هو برنامج إضافي مفتوح المصدر لـ ImageJ يستخدم أدوات متطورة للمعلومات الحيوية لتصنيف وحدات البكسل باستخدام خوارزميات التعلم الآلي15،16. هذا الأسلوب هو “تدريب” حيث أنه يتعلم من تصنيف المستخدم من شرائح من بكسل وتطبيق التصنيف الجديد المستفادة على الصور الأخرى. تعتمد هذه الطريقة على أدوات التحليل الشائعة ضمن برنامج ImageJ التي تستخدم “لتصنيف” كل بكسل في مقطع على أنه ينتمي إلى “فئة” معينة. بمجرد أن يتعلم البرنامج “المصنفات”، يمكن استخدامها لتحديد شرائح أخرى مصنفة مماثلة داخل نفس الصورة. ثم يتم حفظ هذا النموذج وتطبيقه على مجموعات أخرى من الصور ضمن نفس التجربة.
العقبات الحالية لتحديد ecDNA في الموقع في أقسام الكلى هو ذاتي endfluorescence الذاتية من التثبيت في formalin وتحليل العمالة الكثيفة من الصور. نحن نصف هنا كيفية إخماد هذا autofluorescence، والكشف عن ecDNA، واستخدام التعلم الآلي تحت إشراف لقياس الإنتاجية عالية من ecDNA. لقد سبق أن نشرنا قياس NETs وMPO خارج الخلية (ecMPO) باستخدام ماكرو في ImageJ ، ونحن الآن نبرهن شبه أتمتة هذه الأساليب باستخدام التعلم الآلي تحت إشراف1. نحن نبرهن على قدرة على التكيف مع أداة التعلم الآلي، لتصنيف بقعة بديلة لـ NETs و ecMPO داخل نفس الصورة. ويمكن ترجمة هذه الأساليب تلطيخ المذكورة هنا للكشف عن ecDNA، NETs وecMPO إلى الأجهزة الصلبة الأخرى والأمراض حيث ecDNA, NETS وecMPO يلعب دورا في إدامة المرض مثل التهاب المفاصل الروماتويدي والذئبة17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
توجد بروتوكولات متعددة تقيس علامات البروفات في المصل والبول لكل من المرضى ونماذج الماوس من التهاب الكريات. يسمح هذا البروتوكول الموصوف بتحليل منتجات موت الخلايا (ecDNA وNETs وecMPO) داخل الكبيات مباشرة. الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو إعداد الأنسجة والتصوير. العنصر الرئيسي المقيد لاس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف موناش التصوير الصغرى لاستخدام نيكون C1 تستقيم مجهر الليزر confocal ومنصة الهستولوجيا موناش لمعالجة أنسجة الكلى.
Materials
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
References
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
- Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
- Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
- Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
- Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
- Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
- Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
- Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
- Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).
