Apprendimento automatico supervisionato per la semi-quantificazione del DNA extracellulare in Glomerulonephritis
Summary
Il DNA extracellulare (ecDNA) rilasciato durante la morte cellulare è infiammatorio e contribuisce all’infiammazione. La misurazione dell’ecDNA nel sito della lesione può determinare l’efficacia del trattamento terapeutico nell’organo bersaglio. Questo protocollo descrive l’uso di uno strumento di apprendimento automatico per automatizzare la misurazione dell’ecDNA nel tessuto renale.
Abstract
La morte delle cellule glomeriari è una caratteristica patologica della mieloperossia anti-neutrofia anticorpo associato all’anticorpo (MPO-AAV). L’acido deossiribonucleico extracellulare (ecDNA) viene rilasciato durante diverse forme di morte cellulare, tra cui apoptosi, necrosi, necrotosi, trappole extracellulari neutrofiche (NET) e piroptosi. La misurazione di questa morte cellulare richiede molto tempo con diversi biomarcatori necessari per identificare le diverse forme biochimiche di morte cellulare. La misurazione dell’ecDNA è generalmente condotta nel siero e nelle urine come surrogato per danni renali, non nell’organo bersaglio effettivo in cui si verifica la lesione patologica. L’attuale difficoltà nello studio dell’ecDNA nel rene è la mancanza di metodi per formalina tessuto incorporato di paraffina fissa (FFPE) sia sperimentalmente che in biopsie renali umane archiviate. Questo protocollo fornisce un riepilogo dei passaggi necessari per macchiare l’ecDNA nel tessuto FFPE (sia umano che murino), dissetare l’autofluorescenza e misurare l’ecDNA nelle immagini risultanti utilizzando uno strumento di apprendimento automatico dal plugin Weka addestrabile a livello di immagine pubblicamente disponibile. La segmentazione Weka addestrabile viene applicata all’ecDNA all’interno del glomeruli dove il programma impara a classificare l’ecDNA. Questo classificatore viene applicato alle successive immagini renali acquisite, riducendo la necessità di annotazioni manuali di ogni singola immagine. L’adattabilità della segmentazione trainabile di Weka è ulteriormente dimostrata nel tessuto renale da glomerulofoftite sperimentale (GN), per identificare NET ed ecMPO, contributori patologici comuni all’anti-MPO GN. Questo metodo fornisce un’analisi oggettiva dell’ecDNA nel tessuto renale che dimostra chiaramente l’efficacia in cui il programma di segmentazione Weka trainingable può distinguere l’ecDNA tra tessuto renale normale sano e tessuto renale malato. Questo protocollo può essere facilmente adattato per identificare ecDNA, NET ed ecMPO in altri organi.
Introduction
La mieloperossia anti-neutrofila anticorpo associato all’anticorpo (MPO-AAV) è una malattia autoimmune che si traduce in insufficienza renale da lesioni glomeriula patologiche con notevole morte cellulare e rilascio di acido deossiribonucleico (DNA)1,2. Il DNA può attivare il sistema immunitario agendo come un segnale di pericolo. In condizioni di salute normali, la posizione nucleare del DNA offre protezione dall’esposizione al sistema immunitario. L’autoDNA che viene rilasciato extracellulare durante i processi patogeni o l’autoimmunità è visto dal sistema immunitario come un potente danno proinfiammatorio associato all’autoproteina molecolare (DAMP)3. Il DNA extra cellulare (ecDNA) viene rilasciato dalle cellule morenti attraverso diversi meccanismi distinti che sono governati da vie biochimiche distinte, come l’apoptosi, la formazione di trapeextra extracellulari di necroptosi neutrosi(NET), necrosi o piroptosi4,5,6,7.8
In questo articolo vengono descritti i metodi per macchiare e misurare l’ecDNA rilasciato dalle cellule morenti in sezioni di reni formalina fixed paraffina incorporata (FFPE) da biopsie sperimentali anti-MPO GN e renali di pazienti con MPO-AAV9,10. Esistono diversi metodi per la rilevazione di DNA a doppio filamento circolante (dsDNA) e complessi di DNA sia da siero che da urina e da analisi in vitro11,12. Questi metodi, sebbene accurati nel determinare la quantità di ecDNA, non determinano dove l’ecDNA viene rilasciato anatomicamente. Ci sono metodi che descrivono la misurazione specifica dell’ecDNA come il tunel per l’apoptosi e la misurazione dei detriti cellulari13,14. Non esiste un metodo che descriva la misurazione dell’ecDNA culminato da tutte le forme di morte cellulare nei reni FFPE dove si verifica il danno patologico. Questo è importante per determinare se i trattamenti terapeutici sperimentali stanno cancellando l’ecDNA dai siti di lesione patologica nell’organo bersaglio effettivo.
L’acquisizione di più immagini da campioni di rene crea un volume elevato di dati che viene analizzato comunemente da un singolo utente. Questo è laborioso, richiede tempo e può essere soggetto a riproducibilità inaffidabile da parte di altri utenti, a causa di pregiudizi dell’utente. Trainable Weka segmentation è un plugin software open source per ImageJ che utilizza strumenti bioinformatici all’avanguardia per classificare i pixel utilizzando algoritmi di apprendimento automatico15,16. Questo metodo è “trainabile” per cui apprende dalla classificazione dell’utente dei segmenti di pixel e applica la nuova classificazione appresa ad altre immagini. Questo metodo si basa su strumenti di analisi comuni all’interno del programma ImageJ che vengono utilizzati per “classificare” ogni pixel in un segmento come appartenente a una “classe” specifica. Una volta che il programma apprende i “classificatori”, possono essere utilizzati per identificare altri segmenti classificati simili all’interno della stessa immagine. Questo modello viene quindi salvato e applicato ad altri set di immagini all’interno dello stesso esperimento.
Gli ostacoli attuali alla determinazione dell’ecDNA in situ nelle sezioni renali sono l’autofluorescenza endogena dalla fissazione nella formalina e l’analisi laboriosa delle immagini. Qui descriviamo come eseguire l’uso di questa autofluorescenza, rilevare l’ecDNA e usare l’apprendimento automatico supervisionato per la misurazione ad alta velocità effettiva dell’ecDNA. Abbiamo precedentemente pubblicato la misurazione di NET e MPO extracellulare (ecMPO) utilizzando una macro in ImageJ, ora dimostriamo la semi-automazione di questi metodi utilizzando l’apprendimento automatico supervisionato1. Dimostriamo l’adattabilità dello strumento di apprendimento automatico, per classificare una macchia alternativa per NET ed ecMPO all’interno della stessa immagine. Questi metodi di colorazione descritti qui per rilevare ecDNA, NET ed ecMPO possono essere tradotti in altri organi solidi e malattie in cui ecDNA, NETS ed ecMPO svolge un ruolo nel perpetuare malattie come l’artrite reumatoide e il lupus17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esistono diversi protocolli che misurano marcatori infiammatori nel siero e nelle urine di entrambi i pazienti e modelli murini di glomerulonephritis. Questo protocollo descritto consente l’analisi dei prodotti di morte cellulare (ecDNA, NET ed ecMPO) all’interno del glomerulus direttamente. I passaggi più importanti in questo protocollo sono la preparazione e l’imaging dei tessuti. Il principale elemento restrittivo dell’uso di un metodo di colorazione fluorescente per l’analisi è l’autofluorescenza del tessuto. Il te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo Monash Micro Imaging per l’uso del microscopio a scansione laser confocale confocale Nikon C1 e della piattaforma monash Histologia per la lavorazione del tessuto renale.
Materials
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
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