Summary

Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de pseudomonas aeruginosa ferida

Published: February 20, 2020
doi:

Summary

Descrevemos um protocolo de inoculação atrasado para gerar infecções crônicas de feridas em camundongos imunocompetentes.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é um grande patógeno nosocomial de crescente relevância para a saúde e doença humana, particularmente no cenário de infecções crônicas de feridas em pacientes diabéticos e hospitalizados. Há uma necessidade urgente de modelos de infecção crônica para auxiliar na investigação da patogênese ferida e no desenvolvimento de novas terapias contra esse patógeno. Aqui, descrevemos um protocolo que usa inoculação atrasada 24 horas após ferimentos excisional de espessura total. A infecção da matriz de feridas provisórias presente neste momento, ou a liberação rápida ou a disseminação da infecção e, em vez disso, estabelece infecção crônica que dura de 7 a 10 dias sem a necessidade de implantação de materiais estranhos ou supressão imunológica. Este protocolo imita um curso temporal típico de infecção pós-operatória em humanos. O uso de uma cepa luminescente P. aeruginosa (PAO1:lux) permite a avaliação diária quantitativa da carga bacteriana para infecções por feridas P. aeruginosa. Este novo modelo pode ser uma ferramenta útil na investigação da patogênese bacteriana e no desenvolvimento de novas terapias para infecções crônicas de feridas P. aeruginosa.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é uma bactéria em forma de vara gram-negativa com crescente relevância para a saúde e doenças humanas. É responsável pela morbidade e mortalidade extensivas em ambientes nosocomiais, particularmente envolvendo infecções por feridas em pacientes imunocomprometidos1,2. O surgimento de cepas multidrogaresistentes deste patógeno proporcionou mais impulso para a investigação de fatores que contribuem para a virulência P. aeruginosa, mecanismos de resistência a antibióticos P. aeruginosa e novos métodos de prevenção e tratamento desta infecção mortal3. Como tal, a necessidade de modelos animais de infecção por feridas crônicas como ferramentas para investigar essas questões de pesquisa nunca foi tão grande.

Infelizmente, muitos modelos animais de infecção por P. aeruginosa tendem a simular infecção aguda com resolução rápida de infecção ou declínio rápido devido à sepse4,5, que não simula adequadamente a natureza frequentemente crônica dessas infecções. Para resolver essa desvantagem, alguns modelos utilizam a implantação de corpos estranhos, como contas de agar, implantes de silicone ou géis alginatos6,7,8. Outros modelos usam camundongos imunocomprometidos devido à idade avançada, obesidade ou diabetes, ou por meios farmacológicos como neutropenia induzida por ciclofosfhamide9,10,11,12. No entanto, ou o uso de materiais estranhos ou hospedeiros imunes comprometidos provavelmente altera o processo inflamatório local, dificultando a compreensão da fisiopatologia envolvida em infecções crônicas de feridas em hospedeiros com sistemas imunológicos normais.

Desenvolvemos um modelo crônico de infecção por ferida de P. aeruginosa em camundongos que envolve inoculação tardia com bactérias após ferimentos excisional. A inoculação retardada permite experimentos que avaliam a carga bacteriana que se estende por pelo menos 7 dias. Este modelo abre novas oportunidades para investigar tanto a patogênese quanto novos tratamentos de infecções crônicas p. aeruginosa.

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Stanford. 1. Preparação e crescimento de bactérias Realizar todo o trabalho com P. aeruginosa e animais com precauções BSL-2 de acordo com o comitê institucional de biossegurança do pesquisador e diretrizes do comitê de uso de animais. Faça todas as etapas descritas aqui envolvendo P. aeruginosa, incluindo a inoculação do rat…

Representative Results

Utilizando uma cepa luminescente de PAO1 com uma codificação plasmídea codificando o sistema de repórteres luxABCDE (PAO1:lux), realizamos ferimentos excisional em camundongos, inoculamos essas feridas com plânctnico P. aeruginosa 24 h depois, e medimos carga bacteriana ao longo do tempo (Figura 1 e Figura 2). Uma imagem representativa obtida usando um sistema óptico de imagem demonstra que este modelo resulta em l…

Discussion

Desenvolvemos um novo modelo de infecção por feridas de inoculação tardia P. aeruginosa. A estratégia de retardar a inoculação com bactérias até 24 h após o ferimento excisional permite a avaliação de infecções por feridas durante um prazo de 1 semana. Usando uma cepa luminescente de P. aeruginosa,é possível rastrear a progressão da infecção ao longo do curso de infecção. O curso mais longo de infecção em comparação com outros modelos de infecção por P. aeruginosa per…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O vetor de construção luminescente pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 foi um presente gracioso de J. Hardy. Os esquemas foram criados com BioRender.com. Agradecemos ao laboratório de G. Gurtner por seus conselhos sobre o modelo de infecção por feridas. Também agradecemos a T. Doyle, do Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging, por sua experiência técnica. Este trabalho foi apoiado por subsídios R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, e subsídios da Stanford SPARK, do Falk Medical Research Trust e da Cystic Fibrosis Foundation (CFF) para p.L.B. C.R.D foi apoiado pela T32AI007502. Uma Bolsa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Gabilan Stanford e uma Lubert Stryer Bio-X Stanford Interdisciplinar Graduate Fellowship apoiaram j.M.S.

Materials

0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors – Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

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Cite This Article
de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

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