Summary

نموذج التلقيح المتأخر لعدوى الجروح المزمنة الزائفة الجيروجينوسا

Published: February 20, 2020
doi:

Summary

نحن نصف بروتوكول التطعيم المتأخر لتوليد التهابات الجروح المزمنة في الفئران ذات الكفاءة المناعية.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)هو أحد مسببات الأمراض الرئيسية nosocomial ذات الصلة المتزايدة لصحة الإنسان والمرض, لا سيما في وضع التهابات الجروح المزمنة في مرضى السكري والمستشفيات. هناك حاجة ملحة لنماذج العدوى المزمنة للمساعدة في التحقيق في مسببات الجروح وتطوير علاجات جديدة ضد هذا العامل الممرض. هنا ، نصف بروتوكول يستخدم التطعيم المتأخر بعد 24 ساعة من جرح الاستئصال الكامل السماكة. عدوى مصفوفة الجرح المؤقت الحالي في هذا الوقت إما إحباط التطهير السريع أو نشر العدوى وبدلا من ذلك يؤسس العدوى المزمنة تستمر 7-10 أيام دون الحاجة إلى زرع مواد أجنبية أو قمع المناعة. يحاكي هذا البروتوكول مسارًا زمنيًا نموذجيًا للعدوى بعد الجراحة في البشر. استخدام سلالة P. aeruginosa الإنارة (PAO1:lux) يسمح للتقييم الكمي اليومي للعبء البكتيري لالتهابات الجروح P. aeruginosa. قد يكون هذا النموذج الجديد أداة مفيدة في التحقيق في الإمراض البكتيري وتطوير علاجات جديدة لالتهابات الجروح P. aeruginosa المزمنة.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)هي بكتيريا على شكل قضيب سلبي الغرام مع زيادة صلتها بصحة الإنسان والمرض. وهي مسؤولة عن المراضة والوفيات واسعة النطاق في البيئات nosocomial، ولا سيما التي تنطوي على التهابات الجروح في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة1،2. وقد وفرت ظهور سلالات مقاومة للأدوية المتعددة من هذا العامل الممرض المزيد من الزخم للتحقيق في العوامل التي تسهم في فوعة P. aeruginosa ، وآليات مقاومة المضادات الحيوية P. aeruginosa ، وأساليب جديدة للوقاية والعلاج من هذه العدوى القاتلة3. وعلى هذا النحو، فإن الحاجة إلى نماذج الحيوانات من عدوى الجروح المزمنة كأدوات للتحقيق في هذه الأسئلة البحثية لم تكن أكبر من أي وقت مضى.

لسوء الحظ ، تميل العديد من النماذج الحيوانية من عدوى P. aeruginosa إلى محاكاة العدوى الحادة مع دقة سريعة للعدوى أو الانخفاض السريع بسبب الإنتان4،5، والذي لا يحاكي بشكل كاف الطبيعة المزمنة في كثير من الأحيان لهذه العدوى. لمعالجة هذا العيب ، تستخدم بعض النماذج زرع الأجسام الغريبة مثل حبات الأغار ، أو غرسات السيليكون ، أو هلام الجينات6،7،8. تستخدم نماذج أخرى الفئران التي لا تنقصها المناعة بسبب التقدم في العمر أو السمنة أو مرض السكري ، أو من خلال وسائل دوائية مثل العدلات الناجمة عن السيكلوفوسفاميد9،10،11،12. ومع ذلك ، إما أن استخدام المواد الأجنبية أو المضيفين المحصنين يغير على الأرجح العملية الالتهابية المحلية ، مما يجعل من الصعب فهم الفيزيولوجيا المرضية المشاركة في التهابات الجروح المزمنة في المضيفين الذين يعانون من جهاز مناعي طبيعي.

لقد طورنا نموذجًا مزمنًا لعدوى الجروح P. aeruginosa في الفئران التي تنطوي على تأخير التلقيح مع البكتيريا بعد جرح الختان. يسمح التطعيم المتأخر بإجراء تجارب لتقييم العبء البكتيري الذي يمتد إلى 7 أيام على الأقل. هذا النموذج يفتح فرصا جديدة للتحقيق في كل من الإمراض والعلاجات الجديدة للالتهابات المزمنة P. aeruginosa.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها (IACUC) في جامعة ستانفورد. 1. إعداد ونمو البكتيريا إجراء جميع الأعمال مع P. aeruginosa والحيوانات مع احتياطات BSL-2 لكل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية للباحث والمبادئ التوجيهية للجنة ?…

Representative Results

باستخدام سلالة الإنارة من PAO1 مع البلازميد ترميز نظام مراسل luxABCDE (PAO1:lux)، قمنا بإجراء جرح الختان على الفئران، وتلقيح هذه الجروح مع العوالق P. aeruginosa 24 ح في وقت لاحق، وقياس العبء البكتيري على مر الزمن(الشكل 1 والشكل 2). صورة تمثيلية تم الحصو?…

Discussion

لقد وضعنا رواية تأخر التطعيم P. aeruginosa نموذج عدوى الجرح. استراتيجية تأخير التطعيم مع البكتيريا حتى 24 ساعة بعد جرح الختان تمكن من تقييم التهابات الجروح على مدى فترة زمنية 1 أسبوع. باستخدام سلالة الإنارة من P. aeruginosa، فمن الممكن لتتبع تطور العدوى في جميع أنحاء دورة العدوى. وسيتيح المسا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وكان pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 الإنارة بناء ناقلات هدية كريمة من J. هاردي. تم إنشاء التخطيطات مع BioRender.com. نشكر مختبر (جي غورتنر) على نصائحهم بشأن نموذج عدوى الجروح كما نشكر ت. دويل من مركز ستانفورد للابتكار في التصوير في فيفو على خبرته التقنية. تم دعم هذا العمل من خلال المنح R21AI133370، R21AI133240، R01AI12492093، والمنح من ستانفورد سبارك، وثقة الأبحاث الطبية فالك ومؤسسة التليف الكيسي (CFF) إلى P.L.B. C.R.D كان مدعوما من قبل T32AI007502. زمالة خريج ة في جامعة غابلان ستانفورد للعلوم والهندسة وزمالة لوبرت ستراير بيو-إكس ستانفورد للدراسات العليا متعددة التخصصات تدعم J.M.S.

Materials

0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors – Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  2. Serra, R., et al. Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (5), 605-613 (2015).
  3. Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).
  4. Secor, P. R., et al. Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo. Infection and Immunity. 85 (1), (2017).
  5. Rice, S. A., et al. The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage. The ISME Journal. 3 (3), 271-282 (2009).
  6. Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection. Scientific Reports. 6, 35838 (2016).
  7. van Gennip, M., et al. Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo. Infection and Immunity. 80 (8), 2601-2607 (2012).
  8. Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
  9. Zhao, G., et al. Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model. Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).
  10. Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age. Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).
  11. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  12. Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).
  13. Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. , (2019).
  14. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363 (6434), (2019).

Play Video

Cite This Article
de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

View Video