Summary

Een vertraagde inenting model van chronische Pseudomonas aeruginosa wondinfectie

Published: February 20, 2020
doi:

Summary

We beschrijven een vertraagd inentingsprotocol voor het genereren van chronische wondinfecties bij immunocompetente muizen.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is een belangrijke nosocomiale ziekteverwekker van toenemende relevantie voor de menselijke gezondheid en ziekte, met name bij het instellen van chronische wondinfecties bij diabetes en gehospitaliseerde patiënten. Er is dringend behoefte aan chronische infectiemodellen om te helpen bij het onderzoek naar wondpathogenese en de ontwikkeling van nieuwe therapieën tegen deze ziekteverwekker. Hier beschrijven we een protocol dat 24 uur na het voldikte excisional verwonden gebruik maakt van vertraagde inenting. De infectie van de voorlopige wondmatrix die op dit moment aanwezig is, verhindert ofwel snelle klaring of verspreiding van infectie en zorgt in plaats daarvan voor chronische infectie die 7-10 dagen duurt zonder dat er geen vreemde materialen of immuunonderdrukking nodig zijn. Dit protocol bootst een typisch temporele loop van postoperatieve infectie bij mensen na. Het gebruik van een lichtgevende P. aeruginosa stam (PAO1:lux) maakt een kwantitatieve dagelijkse beoordeling van bacteriële last voor P. aeruginosa wondinfecties mogelijk. Dit nieuwe model kan een nuttig instrument zijn in het onderzoek naar bacteriële pathogenese en de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor chronische P. aeruginosa-wondinfecties.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is een gram-negatieve staafvormige bacterie met toenemende relevantie voor de menselijke gezondheid en ziekte. Het is verantwoordelijk voor uitgebreide morbiditeit en mortaliteit in nosocomiale omgevingen, met name met wondinfecties bij immuungecompromitteerde patiënten1,2. De opkomst van multiresistente stammen van deze ziekteverwekker heeft een verdere impuls gegeven voor onderzoek naar factoren die bijdragen aan p. aeruginosa virulentie, mechanismen van P. aeruginosa antibioticaresistentie, en nieuwe methoden voor preventie en behandeling van deze dodelijke infectie3. Als zodanig is de behoefte aan diermodellen van chronische wondinfectie als instrumenten voor het onderzoeken van deze onderzoeksvragen nog nooit zo groot geweest.

Helaas hebben veel diermodellen van P. aeruginosa-infectie de neiging om acute infectie te simuleren met een snelle oplossing van infectie of snelle afname als gevolg van sepsis4,5, die de vaak chronische aard van deze infecties niet voldoende simuleert. Om dit nadeel aan te pakken, maken sommige modellen gebruik van de implantatie van vreemde lichamen zoals agarkralen, siliconenimplantaten of alginaatgels6,7,8. Andere modellen maken gebruik van muizen die immuungecompromitteerd zijn als gevolg van gevorderde leeftijd, obesitas of diabetes, of via farmacologische middelen zoals cyclofosfate-geïnduceerde neutropenie9,10,11,12. Echter, ofwel het gebruik van vreemde materialen of immuun gecompromitteerde gastheren waarschijnlijk verandert de lokale ontstekingsproces, waardoor het moeilijk is om een goed begrip van de pathofysiologie die betrokken zijn bij chronische wondinfecties in gastheren met anders normaal immuunsysteem te krijgen.

We hebben een chronisch model van P. aeruginosa wondinfectie bij muizen die vertraagde inenting met bacteriën na excisional wond impliceert. Vertraagde inenting maakt experimenten met bacteriële last en zich uitstrekt tot ten minste 7 dagen mogelijk. Dit model opent nieuwe mogelijkheden voor het onderzoeken van zowel pathogenese als nieuwe behandelingen van P. aeruginosa chronische infecties.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik (IACUC) van Stanford University. 1. Voorbereiding en groei van bacteriën Voer al het werk met P. aeruginosa en dieren met BSL-2 voorzorgsmaatregelen volgens de onderzoekers institutionele bioveiligheid comite en dier gebruik comité richtlijnen. Doen alle stappen beschreven hier met Betrekking tot P. aeruginosa, met inbegrip van muis inenting, in een bio…

Representative Results

Met behulp van een lichtgevende stam van PAO1 met een plasmid codering van de luxABCDE reporter systeem (PAO1:lux), voerden we excisional verwonden op muizen, ingeënt deze wonden met planktonische P. aeruginosa 24 uur later, en gemeten bacteriële last na verloop van tijd(Figuur 1 en figuur 2). Een representatief beeld verkregen met behulp van een imaging optisch systeem toont aan dat dit model resulteert in detecteerba…

Discussion

We hebben een nieuwe vertraagde inenting P. aeruginosa wondinfectie model. De strategie van het uitstellen van inenting met bacteriën tot 24 uur na excisional wondwond maakt de evaluatie van wondinfecties over een tijdsbestek van 1 week mogelijk. Door gebruik te maken van een lichtgevende stam van P. aeruginosa,is het mogelijk om infectieprogressie tijdens de infectiecursus te volgen. Het langere verloop van de infectie in vergelijking met andere P. aeruginosa infectie modellen zal nieuwe moge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 luminescente constructvector was een genadig geschenk van J. Hardy. Schema’s zijn gemaakt met BioRender.com. Wij danken het lab van G. Gurtner voor hun advies over het wondinfectie model. We danken T. Doyle van het Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging ook voor zijn technische expertise. Dit werk werd ondersteund door subsidies R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, en subsidies van Stanford SPARK, de Falk Medical Research Trust en de Cystic Fibrosis Foundation (CFF) aan P.L.B. C.R.D. werd ondersteund door T32AI007502. Een Gabilan Stanford Graduate Fellowship for Science and Engineering en een Lubert Stryer Bio-X Stanford Interdisciplinary Graduate Fellowship ondersteund J.M.S.

Materials

0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors – Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  2. Serra, R., et al. Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (5), 605-613 (2015).
  3. Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).
  4. Secor, P. R., et al. Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo. Infection and Immunity. 85 (1), (2017).
  5. Rice, S. A., et al. The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage. The ISME Journal. 3 (3), 271-282 (2009).
  6. Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection. Scientific Reports. 6, 35838 (2016).
  7. van Gennip, M., et al. Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo. Infection and Immunity. 80 (8), 2601-2607 (2012).
  8. Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
  9. Zhao, G., et al. Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model. Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).
  10. Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age. Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).
  11. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  12. Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).
  13. Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. , (2019).
  14. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363 (6434), (2019).

Play Video

Cite This Article
de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

View Video