Makrofaj Alt Kümelerinin ve Stromal Hücrelerinin İnsan ve Fare Miyokardiyal Örneklerden İzolasyon

Makrofajlar kalpte en bol bağışıklık hücre tipi temsil, ve onlarkardiyak yaralanma^1,2,3,4aşağıdaki sağlam inflamatuar ve reparative yanıtlar üreten önemli rol oynamaktadır. Daha önce, grubumuz farklı gelişimsel kökenlerden elde edilen murin kalp makrofajlar iki büyük alt kümesi tespit^5,6. Genel olarak, doku yerleşik kardiyak makrofaj alt kümelerinin farklı popülasyonları CCR2’nin hücre yüzey ekspresyonuna göre tanımlanabilir (C-C motifli kemokin reseptörü 2). CCR2^– makrofajlar (hücre yüzey ekspresyonu: CCR2^–MHCII^düşük ve CCR2^–MHCII^yüksek)embriyonik kökenlidir (ilkel ve eritromiyeloid soylar), kendini yenilemek mümkün, ve homeostatik koşullar altında baskın bir popülasyon temsil. Resident CCR2⁺ makrofajlar kesin hematopoetik kökenlidir, dolaşan monositlerden işe alım yoluyla korunur ve homeostatik koşullar altında küçük bir popülasyonu temsil eder. Fonksiyonel olarak, CCR2^– makrofajlar minimal inflamasyon oluşturmak ve koroner gelişim neonatal kalp rejenerasyonu için kritik^{olan 5,7}. Buna karşılık, CCR2⁺ makrofajlar kardiyak hakaret ler aşağıdaki sağlam inflamatuar yanıtlar başlatmak ve teminat kardiyomiyosit yaralanmasıkatkıda, sol ventrikül olumsuz remodeling, ve kalp yetmezliği ilerlemesi^8,9.

Son zamanlarda, insan miyokardiyum da makrofajlar iki farklı alt kümesi ya CCR2^olarak tanımlanan – ya da CCR2⁺⁸içerdiğini göstermiştir. Gen ekspresyonu ve fonksiyonel analizler, insan CCR2^– ve CCR2⁺ makrofajlar fonksiyonel olarak farklı alt kümeleri temsil ve fonksiyonel CCR2 benzer olduğunu ortaya^– ve CCR2⁺ makrofajlar fare kalp bulundu. İnsan CCR2^– makrofajlar IGF1, PDGF, Cyr61 ve HB-EGF gibi güçlü büyüme faktörleri düzeylerini ifade eder. CCR2⁺ makrofajlar il-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 ve TNF-a gibi iltihabı teşvik kemokinler ve sitokinler zenginleştirilmiştir. Uyarılmış CCR2⁺ makrofajlar kültürde inflamatuar sitokin interlökin-1β (IL-1β) belirgin olarak daha yüksek seviyelerde salgılarlar. Bu alt kümelerin doku onarımına nasıl farklı katkıda bulunduğu ve kardiyak yaralanma bağlamında sol ventrikül (LV) remodeling’in aktif bir araştırma alanı olduğu durmaktadır.

Fare ve insan kalbinde makrofaj heterojenite akış-sitometri tabanlı analizi kardiyak doku sindirerek ve akış sitometrik analiz veya hücre sıralama gibi toplu RNA sıralama / tek hücreli RNA sıralama veya fonksiyonel tahliller için hücreleri kültüre gibi daha fazla aşağı süreçleri için takip tek bir hücre süspansiyon oluşturma gerektirir. Murine kalplerden tek bir hücre süspansiyon yapmak için orijinal protokol ilk Nahrendorf grup tarafından Nahrendorf ve ark 2007^{10 bildirilmiştir.} Laboratuarımız protokolü insan miyokardiyumundan makrofajları çıkarmak için uyarladı ve değiştirdi. Aynı protokolü kullanarak ancak boyama ve gating düzeni hafif değişiklik ile, CD45^– insan miyokardinden stromal hücreleri de hasat edilebilir. Burada sunulan, metin ve video, insan miyokardinden makrofajveya stromal çıkarılması için rutin olarak yapılan bir protokoldür.

Kardiyak doku örnekleri dilate kardiyomiyopati (DCM: idiyopatik veya ailesel) veya iskemik kardiyomiyopati (ICM) sol ventrikül yardımcı cihaz (LVAD) implantasyonu veya kardiyak transplantasyon geçiren erişkin hastalardan elde edilir. Ekskedeki kalpler veya LVAD çekirdekleri sindirim işlemine başlamadan önce intravasküler olarak soğuk tuzlu ile perfüzyonlanır. Yara izi veya yağ dokusu infiltrasyonu derecesi açısından belirlenen doku örneğinin “kalitesi”nin makrofajların verimini büyük ölçüde etkileyebileceği unutulmaması gerekir. Büyük yara izi alanlarına sahip kalp örnekleri çok daha düşük hücre verime sahip olacak ve istenilen downstream analiz yöntemleri in vitro hücre culturing gerektirdiğinde ciddi teknik sınırlama lar oluşturabilir.