인간과 마우스 심근 표본에서 대식세포 하위 세트 및 기질 세포의 분리
Summary
여기서 제시된 프로토콜은 효소 소화를 통해 단일 세포 현탁액을 준비시킴으로써 인간 및 마우스 심근으로부터 대식세포 및 기타 비면역 세포의 다양한 서브세트를 분리하는 프로토콜이다. 유세포분석 기반 식별 및 절연 대식세포의 특성화를 위한 게이팅 방식도 제시된다.
Abstract
대식세포는 심장에서 가장 이질적이고 풍부한 면역 세포 집단을 나타내며 심장 손상 후 염증 및 회복 반응을 유도하는 데 핵심적입니다. 어떻게 대식 세포의 다양 한 하위 집합 심장 부상 후 면역 반응을 조율 연구의 활성 영역. 여기에 제시된 간단한 프로토콜은 우리 실험실이 건강하고 병들인 개인에게서 얻은 마우스와 인간 심근 표본에서 대식세포의 추출을 위해 일상적으로 수행하는 간단한 프로토콜입니다. 간략하게, 이 프로토콜은 항체 염색, 및 유세포 측정에 선행된 단 하나 세포 현탁액을 생성하기 위하여 심장 조직의 효소 소화를 관련시킵니다. 이 기술은 대량 및 단세포 RNA 시퀀싱뿐만 아니라 정렬된 세포에서 수행되는 기능성 분석법에 적합합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 단순성, 최소한의 일일 변동 및 다양한 마우스 모델 및 인간 질병 개체에 대한 대식세포 이질성에 대한 조사를 허용하는 광범위한 적용성입니다.
Introduction
대식세포는 심장에서 가장 풍부한 면역세포 유형을 나타내며, 심장 손상1,2,3,4에이어 강력한 염증 및 회복 반응을 생성하는 데 중요한 역할을 한다. 이전에, 우리 그룹은 뚜렷한 발달 기원5,6에서파생된 뮤린 심혼에 있는 대식세포의 2개의 중요한 부세트를 확인했습니다. 광범위하게, 조직 상주 심장 대식세포 서브세트의 뚜렷한 집단은 CCR2의 세포 표면 발현에 기초하여 확인될 수 있다(C-C 모티프 케모카인 수용체 2). CCR2– 대식세포(세포 표면 발현: CCR2- MHCII낮고 CCR2- MHCII높음)는배아 기원(원시및 적혈구 계보)이며, 자가 갱신할 수 있고, 동압 조건 하에서 지배적인 집단을 나타낸다. 상주 CCR2+ 대식세포는 확실한 조혈 기원이며, 순환 단핵구로부터의 모집을 통해 유지되며, 항상성 조건하에서 소집단을 나타낸다. 기능적으로, CCR2– 대식세포는 최소한의 염증을 생성하고 관상 동맥 발달 신생아 심장 재생에 중요하다5,7. 대조적으로, CCR2+ 대식세포는 심장 모욕에 따라 강력한 염증 반응을 개시하고 부수적인 심근세포 손상, 좌심실의 불리한 리모델링 및 심부전진행에 기여한다8,9.
최근, 우리는 인간 심근이 또한 CCR2– 또는 CCR2+8로유사하게 확인된 대식세포의 2개의 별개의 부집합을 포함한다는 것을 보여주었습니다. 유전자 발현 및 기능적 분석은 인간 CCR2- 및 CCR2+ 대식세포가 기능적으로 서로 다른 서브세트를 나타내며, 마우스 심장에서 발견되는 CCR2 + 대식세포와 기능적으로 유사하다는 것을 밝혀냈습니다. 인간CCR2- 대식세포는 IGF1, PDGF, Cyr61 및 HB-EGF를 포함한 강력한 수준의 성장 인자를 표현합니다. CCR2+ 대식세포는 IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 및 TNF-a와 같은 염증을 촉진하는 케모카인 및 사이토카인에서 풍부하게 함유된다. 자극된 CCR2+ 대식세포는 배양에서 염증성 사이토카인 인터류킨-1β(IL-1β)의 현저하게 높은 수준을 분비한다. 이 분부 집합이 어떻게 달리 조직 수선에 기여하고 심장 상해의 맥락에서 좌심실 (LV) 개조는 적극적인 연구의 지역 남아 있습니다.
마우스와 인간의 심장에서 대식세포 이질성의 흐름 세포 분석 기반 분석은 심장 조직을 소화하고 단일 세포 현탁액을 생성하고 대량 RNA 시퀀싱/단일 세포 RNA 시퀀싱 또는 기능성 분석과 같은 추가 하류 프로세스에 대한 세포 선별을 생성해야 합니다. 뮤린 하트에서 단일 세포 현탁액을 만들기위한 원래 프로토콜은 Nahrendorf 외. 200710에서Nahrendorf 그룹에 의해 처음 보고되었다. 우리의 실험실은 인간의 심근에서 대식세포를 추출하기 위해 프로토콜을 조정하고 수정했습니다. 동일한 프로토콜을 사용하지만 염색 및 게이팅 방식에서 약간의 변형으로,CD45-인간 심근으로부터의 기질 세포도 수확될 수 있다. 여기에 제시된 텍스트 및 비디오에서, 인간 심근으로부터 대식세포 또는 기질의 추출을 위해 일상적으로 수행되는 프로토콜이다.
심장 조직 견본은 확장된 심근병증 (DCM: 특발성 또는 가족) 또는 허혈성 심근병증 (ICM)을 겪고 있는 좌심실 보조 장치 (LVAD) 이식 또는 심장 이식을 가진 성인 환자에게서 얻어진다. 심이식 심질 또는 LVAD 코어는 소화 절차를 시작하기 전에 차가운 식염수와 함께 혈관이 심어져 있습니다. 흉터 또는 지방 조직 침투의 정도에서 결정 된 조직 표본의 “품질”은 대식세포의 수율에 크게 영향을 미칠 수 있음을 유의하는 것이 중요합니다. 흉터의 넓은 지역을 가진 심혼 견본은 훨씬 더 낮은 세포 수율을 가질 것이고 원하는 다운스트림 분석 방법 체외 세포 배양을 요구할 때 심각한 기술적 한계를 제기할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 인간 심근으로부터 다양한 대식세포 서브세트를 추출할 수 있게 한다. 이 프로토콜은 간단하며 FACS 분석을 위해 준비된 단일 셀 현탁액을 준비하는 데 3~4시간이 걸립니다. 프로토콜은 수행하기가 비교적 간단하지만 가변성을 최소화할 수 있는 특정 기술적 측면을 고려해야 합니다. 첫째, 최적의 세포 생존을 위해 인간 조직과 적시에 작업하는 것이 필요합니다. 세포 사멸을 최소화?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 워싱턴 대학의 아동 발견 연구소와 세인트 루이스 아동 병원 (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), 반스 유대인 병원 재단 (8038-88), NHLBI (R01)에서 제공하는 기금으로 가능했습니다. HL138466, R01 HL139714). K.J.L.은 NIH K08 HL123519 및 버로우스 웰컴 펀드(1014782)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petridishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
