Summary

בידוד של מקרופאג קבוצות מערכות ותאים סטרומה מתוך שריר הלב של האדם והעכבר דגימות

Published: December 17, 2019
doi:

Summary

מוצג כאן הוא פרוטוקול לבידוד קבוצות מערכות שונות של מקרופאגים ותאים אחרים שאינם חסינים מפני שריר הלב של האדם והעכבר על ידי הכנת תא השעיה יחיד באמצעות עיכול אנזימטי. מערכות המשך הזדהות לצורך זרימה cy, מבוססי זיהוי ואפיון של מקרופאגים מבודדים מוצגים גם.

Abstract

מקרופאגים מייצגים את אוכלוסיית התא הטרוגנית ביותר ושופע החיסונית בלב הם מרכזיים בנהיגה בדלקת ותגובות מענה לאחר פציעה לב. כיצד קבוצות מערכות שונות של מקרופאגים לארגן את התגובות החיסונית לאחר פגיעה בלב הוא תחום פעיל של מחקר. מוצג כאן הוא פרוטוקול פשוט כי המעבדה שלנו מבצעת באופן שגרתי, עבור החילוץ של מקרופאגים מן העכבר ושריר הלב האנושי באמצעות דגימות שהתקבלו מאנשים בריאים וחולים. בקצרה, פרוטוקול זה כרוך בעיכול אנזימטי של רקמת הלב כדי ליצור השעיה תא בודד, ואחריו כתמים נוגדן, ולזרום cy, לנסות. טכניקה זו מתאימה עבור בחני פונקציונלי שבוצעה על תאים ממוינים, כמו גם בצובר תאים בודדים RNA ברצף. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא הפשטות שלה, יום מינימלי הווריאציה היום והישימות רחב המאפשר חקירה של מקרופאג טרוגניות על פני מודלים העכבר השונים ישויות המחלה האנושית.

Introduction

מקרופאגים מייצגים את הסוג הנפוץ ביותר התא החיסונית בלב, והם משחקים תפקידים משמעותיים ביצירת מענה דלקתי ומשנה תגובות בעקבות פגיעה לב1,2,3,4. בעבר, הקבוצה שלנו זיהה שתי קבוצות מערכות מרכזיות של מקרופאגים בליבו של מוראו נגזר ממקורותהתפתחותיים ברורים 5,6. באופן כללי, אוכלוסיות נפרדות של הרקמה תושב מקרופאג מערכות המשנה הלב יכול להיות מזוהה מבוסס על הביטוי משטח התא של CCR2 (C-C מוטיב קולטן כימוקין 2). CCR2 מקרופאגים (משטח התא ביטוי: CCR2MHCIIנמוך ו CCR2mhciiגבוה) הם של מוצא עובריים (פרימיטיבי ואריטרומטיות לינאואיד), מסוגל לחדש את עצמו, ולייצג אוכלוסייה דומיננטית תחת תנאים הומסטטיים. תושב CCR2+ מקרופאגים הם של מוצא מוחלט המטופאות, נשמרים באמצעות גיוס מתוך במחזור מונוציטים, ומייצגים אוכלוסיה קטין תחת תנאים הומסטטיים. פונקציונלית, CCR2 מקרופאגים ליצור דלקת מינימלית הם קריטיים להתפתחות כלילית בלב התחדשות הלב5,7. לעומת זאת, CCR2+ מקרופאגים ליזום תגובות דלקתיות חזקים בעקבות עלבונות לב ולתרום לפציעה קרדיולוגית מודלקת, שיפוץ לוואי של החדר השמאלי, ואת אי ספיקת לב התקדמות8,9.

לאחרונה, הצגנו שריר הלב האנושי גם מכיל שתי קבוצות מערכות נפרדות של מקרופאגים המזוהים באופן דומהגם CCR2 או CCR2+8. ביטוי גנים וניתוחים פונקציונליים חשף כי האדם CCR2 ו CCR2+ מקרופאגים לייצג תת מערכות מבחינה פונקציונלית ו הם אנלוגית פונקציונלית CCR2 ו CCR2 מקרופאגים נמצא בלב העכבר. האדם CCR2 מקרופאגים לבטא רמות עמידות של גורמי גדילה, כולל IGF1, Pdgf, Cyr61, ו-HB-egf. CCR2+ מקרופאגים מועשרים נוגדנים ו ציטוקינים המעודדים דלקת, כגון il-1b, il-6, ccl-2, ccl-7, ו-tnf-a. מגורה CCR2+ מקרופאגים להפריש רמות גבוהות במידה ניכרת של ציטוקינים דלקתיות interleukin-1β (IL-1β) בתרבות. כיצד ערכות המשנה הללו לתרום באופן מהותי לתיקון רקמות ושמאלית חדרית (LV) שיפוץ בהקשר של פציעה בלב נשאר שטח של מחקר פעיל.

זרימה-cyמקרופאג try ניתוח מבוסס של טרוגניות בעכבר וללב האדם דורש לעכל את רקמת הלב ויצירת השעיית תא יחיד ואחריו הניתוח cy, מיון התא עבור תהליכים נוספים במורד הזרם כגון בצובר ברצף RNA/תא יחיד RNA רצפי או culturing תאים עבור assays פונקציונלי. הפרוטוקול המקורי לביצוע השעיית תא בודד מלבבות מורדין דווחו לראשונה על ידי קבוצת נחרנדורף בנחדורף ואח ‘. 200710. המעבדה שלנו הותאמה ושינתה את הפרוטוקול לחלץ מקרופאגים משריר הלב האנושי. באמצעות הפרוטוקול אותו אך עם שינוי קל בצביעת והערכה, התאים CD45 סטרומה משריר הלב האנושי וניתן גם לקצור. מוצג כאן, בטקסט ובווידאו, הוא פרוטוקול המתבצע באופן שגרתי עבור חילוץ של מקרופאגים או סטרומה משריר הלב האנושי.

דגימות של רקמות לב מתקבלים מחולים מבוגרים עם שריר הלב מורחבים (DCM: אידיופטית או משפחתית) או מחלת שריר הלב (ICM) שעברו שמאל חדרית לסייע המכשיר (LVAD) השרשה או השתלת לב. לבבות הסבר או ליבות LVAD הם בלתי מפותחים עם תמיסת מלח קר לפני תחילת תהליך העיכול. חשוב לציין כי “איכות” של הדגימה הרקמה נקבע במונחים של מידת צלקות או הסתננות רקמת שומן יכול מאוד להשפיע על התשואה של מקרופאגים. דגימות לב עם אזורים גדולים של צלקות יהיה הרבה יותר תאים התשואה הנמוכה והוא יכול להוות מגבלה טכנית רצינית כאשר הרצוי המטה ניתוח שיטות דורשים תא מתורבת culturing.

Protocol

הפרוטוקול המוצג אושר על ידי אוניברסיטת וושינגטון בלוח הסקירה המוסדי של סנט לואיס (#201305086). כל הנושאים מעניקים הסכמה מושכלת לפני איסוף המדגם והניסויים מתבצעים בהתאם לפרוטוקול הלמידה המאושר. הפרוטוקול המוצג מבוצע עם אישור של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש באוניברסיטת וושינגטון בב…

Representative Results

הפרוטוקול תיאר מאפשר בידוד של מקרופאגים מהעכבר ושריר הלב האנושי. באמצעות הפרוטוקול אותו, אבל עם כתמים שונים האסטרטגיה לאחר הפעולה, התאים סטרומה יכול גם להיות נקצרו משריר הלב האנושי. תוצאות FACS המוצגות כאן נרכשו על פלטפורמת השלישי BD או BD. שולטת הפיצוי נוצרו מדגימות של בקרת …

Discussion

הפרוטוקול מאפשר חילוץ של תת קבוצות ממקרופאג שונות משריר הלב האנושי. הפרוטוקול הוא פשוט ולוקח 3 כדי 4 שעות כדי להכין ההשעיה תא יחיד מוכן ניתוח FACS. למרות שהפרוטוקול הוא פשוט יחסית לביצוע, ישנם היבטים טכניים מסוימים שצריך להיחשב שיצמצם את השונות. ראשית, עבודה בזמן האופנה עם רקמת האדם היא הכרחי?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרויקט זה התאפשר על ידי מימון המסופק ממכון גילוי הילדים של אוניברסיטת וושינגטון וביה לילדים סנט לואיס (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), הקרן של בארנס-בית חולים יהודי (8038-88), ו NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. נתמך על ידי NIH K08 HL123519 ובורוז קרן ברוך הבא (1014782).

Materials

15 mL Conocal Tubes Thermo Fisher 14-959-53A
40 µm Cell Strainers Thermo Fisher 50-828-736
50 mL Conical Tubes Thermo Fisher 352098
ACK Lysis Buffer Gibco A10492-01
Bovine Serum Albumin Sigma A2058
Collagenase 1 Sigma C0130-1G
DAPI Thermo Fisher D1306
DMEM 1x Gibco 11965-084
DNAse 1 Sigma D4527-20KU
DRAQ5 Thermo Fisher 62251
EDTA 0.5M pH 8 Corning 46-034-CI
Enzyme Deactivating Buffer 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA
FACS Buffer 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M)
Fetal Bovine Serum Gibco A3840201
Forceps VWR 82027-406
HBSS 1x Gibco 14175-079
Hemostats VWR 63042-052
Hyaluronidase type 1-s Sigma H3506-500MG
PBS 1x Gibco 14190-136
Petridishes Thermo Fisher 172931
Razor Blade VWR 55411-050
Scissors VWR 82027-578

References

  1. Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
  2. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  3. Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
  4. Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  5. Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
  6. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  7. Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
  8. Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
  9. Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
  10. Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).

Play Video

Cite This Article
Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens. J. Vis. Exp. (154), e60015, doi:10.3791/60015 (2019).

View Video