Summary

Rapamisin/mTOR etkileşimini incelemek için Yarı Kantitatif İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS)

Published: August 27, 2019
doi:

Summary

Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri izleyerek ve protein-ligand etkileşimlerinin yakınlığını tahmin ederek DARTS deneyinin veri analizi yeteneklerini geliştirdik. Etkileşimler iki eğriye çizilebilir: proteolitik eğri ve doz bağımlılığı eğrisi. MTOR-rapamisin etkileşimini örnek bir vaka olarak kullandık.

Abstract

İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS) yeni küçük molekül protein hedeflerinin tespiti için sağlam bir yöntemdir. Bilinen küçük molekül-protein etkileşimlerini doğrulamak ve doğal ürünler için potansiyel protein hedeflerini bulmak için kullanılabilir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, DARTS yerli, değiştirilmemiş, küçük moleküller kullanır ve basit ve kullanımı kolaydır. Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri izleyerek ve protein-ligand etkileşimlerinin yakınlığını tahmin ederek DARTS deneyinin veri analizi yeteneklerini daha da geliştirtik. Protein-ligand etkileşimleri iki eğriye dönüştürülebilir: proteolitik eğri ve doz bağımlılığı eğrisi. MTOR-rapamisin etkileşimini protokolümüzün kurulması için örnek bir örnek olarak kullandık. Proteolitik eğriden pronase tarafından mTOR proteozisinin rapamisin varlığı ile inhibe edildiğini gördük. Doz bağımlılığı eğrisi bize rapamisin ve mTOR bağlayıcı yakınlık tahmin etmek için izin verdi. Bu yöntem, yeni hedef proteinlerin doğru bir şekilde tanımlanması ve uyuşturucu hedef etkileşiminin optimizasyonu için güçlü ve basit bir yöntem olması muhtemeldir.

Introduction

Küçük molekül hedef proteinlerin belirlenmesi mekanistik anlayış ve potansiyel terapötik ilaçların gelişimi için gereklidir1,2,3. Affinity kromatografisi, küçük moleküllerin hedef proteinlerini tanımlamak için klasik bir yöntem olarak, iyi sonuçlar vermiştir4,5. Ancak, bu yöntem, küçük moleküllerin kimyasal modifikasyongenellikle azaltılmış veya değiştirilmiş bağlayıcı özgüllük veya yakınlık ile sonuçlanır, sınırlamalar vardır. Bu sınırlamaları aşmak için, son zamanlarda küçük moleküllerin kimyasal modifikasyonu olmadan küçük molekül hedeflerini belirlemek için çeşitli yeni stratejiler geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Etiketsiz küçük moleküllerin hedef tanımlaması için bu doğrudan yöntemler arasında ilaç afiniteduyarlı hedef stabilitesi (DARTS)6, oksidasyon oranlarından proteinlerin stabilitesi (SPROX)7, hücresel termal değişim töz (CETSA)8 ,9, ve termal proteom profilleme (TPP)10. Doğal, değiştirilmemiş küçük moleküller kullandıkları ve hedef proteinleri bulmak için sadece doğrudan bağlayıcıetkileşimlere güvendikleri için bu yöntemler son derece avantajlıdır 11.

Bu yeni yöntemler arasında, DARTS kolayca en laboratuvarları12,13tarafından kabul edilebilir nispeten basit bir metodolojidir. DARTS, ligand bağlı proteinlerin bağlanmamış proteinlere göre enzimatik bozulmaya karşı modifiye duyarlılığı gösterdiği kavramına bağlıdır. Yeni hedef protein sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile SDS-PAGE jelindeki değiştirilmiş bandın incelenmesi ile saptanabilir. Bu yaklaşım başarıyla doğal ürün ve ilaçların daha önce bilinmeyen hedeflerinin belirlenmesi için uygulanmıştır14,15,16,17,18, 19. Aynı zamanda belirli bir protein20,21bileşiklerin bağlayıcı doğrulamak veya ekrana bir araç olarak güçlüdür. Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri küçük moleküllerle izleyerek ve protein-ligand bağlayıcı afiyetleri tanımlayarak deneyde bir iyileşme sayılmayı savuruyoruz. Yaklaşımımızı göstermek için mTOR-rapamycin etkileşimini örnek olarak kullanıyoruz.

Protocol

1. Hücreleri toplama ve düzenlil % 10 fetal sığır serumu, 2 mM glutamin ve% 1 antibiyotik ile Dulbecco modifiye Eagle orta (DMEM) kullanarak 293T hücreleri büyümek. 37 °C’de %5 CO2’nin altında kuluçka kültürleri .NOT: Hücrelerin büyüme durumu sonraki deneylerin kararlılığını etkileyebilir. 80\u201290% biraraya ulaşana kadar kültür hücreleri genişletin. 345 μL hücre lisis reaktifini (Malzeme Tablosunabakın) 25 μL 20x proteaz inhibi…

Representative Results

Deneyin akış şeması Şekil1’de özetlenmiştir. Coomassie mavi boyama sonucu Şekil2’de gösterilmiştir. Küçük molekül ile kuluçka proteoziz karşı koruma sağlar. Araç kontrolü üzerinde rapamisin ile kuluçka ile korunuyor gibi görünen üç bant bulunur. Proteolitik eğri deneyinden beklenen sonuçlar Şekil3’te gösterilmiştir. Bir kanıtı olarak, biz iyi çalışılmış protein mTOR, hangi ilaç rapamycin<sup c…

Discussion

DARTS, protein bağlamanın bozulmaya karşı koruyucu etkisinden yararlanarak küçük molekül hedeflerinin belirlenmesini sağlar. DARTS herhangi bir kimyasal modifikasyon veya küçük molekül26immobilizasyon gerektirmez. Bu küçük moleküllerin doğrudan bağlayıcı protein hedeflerini belirlemek için kullanılmasını sağlar. Klasik DARTS yöntemi için standart değerlendirme kriterleri jel boyama, kütle spektrometresi ve batı leke12,13içerir.<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen NIH araştırma hibe R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484 ve DOD araştırma hibe W81XWH-16-16-0482 tarafından desteklenmiştir.

Materials

100X Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Dilute to 20X with ultrapure water
293T cell line ATCC CRL-3216 DMEM medium with 10% FBS
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher 23225
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Cell scraper Thermo Fisher 179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution Bio-Rad 1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma-Aldrich D2650
GraphPad Prism GraphPad Software Version 6.0 statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52 image processing and analysis software
M-PER Cell Lysis Reagent Thermo Fisher 78501
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning R21-040-CV
Pronase Roche PRON-RO 10 mg/ml
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium fluoride Sigma-Aldrich S7920
Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich 450243
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich 221368
Trizma base Sigma-Aldrich T1503 adjust to pH 8.0
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

References

  1. Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
  2. O’Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
  3. McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
  4. Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
  5. Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
  6. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
  7. Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
  8. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  9. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  10. Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
  11. Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
  12. Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
  13. Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
  14. Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
  15. Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
  16. Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
  17. Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
  18. Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
  19. Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
  20. Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
  21. Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
  22. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  23. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  24. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
  25. Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
  26. Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
  27. Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
  28. Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhang, C., Cui, M., Cui, Y., Hettinghouse, A., Liu, C. A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction. J. Vis. Exp. (150), e59656, doi:10.3791/59656 (2019).

View Video