Summary

יחסי למחצה כמותית של התרופה מגיב יציבות היעד (חצים) שיטת לימוד האינטראקציה Rapamycin/mTOR

Published: August 27, 2019
doi:

Summary

במחקר זה, הצלחנו לשפר את יכולות ניתוח הנתונים של הניסוי חצים על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים והערכת האהדה של ליגוניות חלבונים ואינטראקציות. ניתן להתוות את האינטראקציות לשתי עקומות: עקומת פרוטחרדה ועקומת תלות במינון. השתמשנו באינטראקציה של mTOR-rapamycin כמקרה מופתי.

Abstract

זיקה לסמים יציבות היעד (משחק דארטס) היא שיטה איתנה לזיהוי מטרות מולקולות קטנות של חלבון מולקולה. ניתן להשתמש בו כדי לאמת אינטראקציות קטנות ומולקולות של חלבונים ולמצוא מטרות חלבון פוטנציאליות עבור מוצרים טבעיים. לעומת שיטות אחרות, חצים משתמש יליד, לא שונה, מולקולות קטנות הוא פשוט וקל לתפעול. במחקר זה, אנו משפרים עוד יותר את יכולות ניתוח הנתונים של הניסוי חצים על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים והערכת הזיקה של חלבונים ליגוניים ואינטראקציות. ניתן להתוות את החלבון-ligand אינטראקציות לשתי עקומות: עקומת פרוטחרדה ועקומת תלות במינון. השתמשנו באינטראקציה של mTOR-rapamycin כמקרה מופתי להקמת הפרוטוקול שלנו. מתוך עקומת נגד חרדה ראינו כי פרוטפוליזיס של mTOR על ידי בינוי היה מעוכב על ידי נוכחות של rapamycin. עקומת תלות המינון אפשרה לנו להעריך את הזיקה המחייב של rapamycin ו mTOR. שיטה זו עשויה להיות שיטה רבת עוצמה ופשוטה לזיהוי מדויק של חלבונים ביעד הרומן ולמיטוב האירוסין של מטרת הסמים.

Introduction

זיהוי מולקולה קטנה היעד חלבונים הוא חיוני הבנה מכניסטית ופיתוח של תרופות טיפוליות פוטנציאליות1,2,3. אהדה כרומטוגרפיה, כשיטה קלאסית לזיהוי חלבונים היעד של מולקולות קטנות, הניב תוצאות טובות4,5. עם זאת, שיטה זו יש מגבלות, בשינוי כימי זה של מולקולות קטנות לעתים קרובות גורמת מופחת או שונה ספציפיות הקשירה או אהדה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, כמה אסטרטגיות חדשות פותחו לאחרונה ויישם כדי לזהות את מטרות המולקולה הקטנה ללא שינוי כימי של מולקולות קטנות. אלה שיטות ישירות לזיהוי היעד של מולקולות קטנות ללא תוויות כוללות עמידות בפני התרופה ביציבות היעד (חצים)6, יציבות של חלבונים משיעורי חמצון (sprox)7, הטלפון התרמי משמרת תרמית (cetsa)8 ,9, ו התרמי פרופיל פרוטדום (tpp)10. שיטות אלה הן יתרון מאוד כי הם משתמשים טבעיים, מולקולות קטנות שאינן בשימוש ולהסתמך רק על אינטראקציות כריכה ישירה למצוא חלבונים היעד11.

בין אלה שיטות חדשות, חצים היא מתודולוגיה פשוטה יחסית שיכולה בקלות להיות מאומצת על ידי רוב מעבדות12,13. החצים תלויים במושג כי חלבונים ליגטיים להפגין שונה רגישות השפלה אנזימטית ביחס לחלבונים לא מאוגדים. חלבון היעד החדש יכול להיות מזוהה על ידי בחינת הלהקה שונה ב SDS-דף ג ‘ ל באמצעות ספקטרומטריה כרומטוגרפיה נוזלית המסה (LC-MS/MS). גישה זו יושמה בהצלחה לזיהוי של מטרות לא ידועות בעבר של מוצרים טבעיים ותרופות14,15,16,17,18 , 19. הוא גם חזק כאמצעי למסך או לאמת קשירה של תרכובות לחלבון מסוים20,21. במחקר זה, אנו מציגים שיפור לניסוי על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים עם מולקולות קטנות וזיהוי ליגולי חלבונים וכריכה. אנו משתמשים באינטראקציה mTOR-rapamycin כדוגמה כדי להדגים את הגישה שלנו.

Protocol

1. לאסוף ולקבל תאים לגדל תאים 293T באמצעות מדיום שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% סרום עוברי, 2 מ”מ גלוטמין ו 1% אנטיביוטיקה. תרבות הדגירה ב 37 ° c תחת 5% CO2.הערה: מצב הגדילה של התאים עלול להשפיע על היציבות של הניסויים הבאים. הרחב את התאים בתרבות עד שנגיע ל-80 \ u201290% זרימה. מערבבים 345 μL של פ?…

Representative Results

תרשים הזרימה של הניסוי מתואר באיור 1. התוצאה של כתמים כחולים Coomassie מוצג באיור 2. הדגירה עם המולקולה הקטנה מקנה הגנה מפני פרוטפוליזיס. שלוש להקות שנראות כהגנה על ידי דגירה עם rapamycin על השליטה ברכב נמצאים. התוצאות הצפויות מניסוי עקומת פרוטחרדה מוצגים <strong class="xfig"…

Discussion

חצים מאפשר זיהוי מטרות מולקולה קטנה על ידי ניצול ההשפעה המגנה של כריכת חלבון נגד השפלה. חצים אינו דורש כל שינוי כימי או השתק של המולקולה הקטנה26. זה מאפשר מולקולות קטנות לשמש כדי לקבוע מטרות החלבון המחייב שלהם ישירה. קריטריוני הערכה סטנדרטיים לשיטת החצים הקלאסיים כוללים כתמים …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי מחקר NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, ומענק מחקר של משרד ההגנה W81XWH-16-1-0482.

Materials

100X Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Dilute to 20X with ultrapure water
293T cell line ATCC CRL-3216 DMEM medium with 10% FBS
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher 23225
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Cell scraper Thermo Fisher 179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution Bio-Rad 1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma-Aldrich D2650
GraphPad Prism GraphPad Software Version 6.0 statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52 image processing and analysis software
M-PER Cell Lysis Reagent Thermo Fisher 78501
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning R21-040-CV
Pronase Roche PRON-RO 10 mg/ml
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium fluoride Sigma-Aldrich S7920
Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich 450243
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich 221368
Trizma base Sigma-Aldrich T1503 adjust to pH 8.0
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

References

  1. Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
  2. O’Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
  3. McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
  4. Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
  5. Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
  6. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
  7. Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
  8. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  9. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  10. Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
  11. Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
  12. Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
  13. Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
  14. Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
  15. Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
  16. Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
  17. Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
  18. Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
  19. Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
  20. Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
  21. Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
  22. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  23. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  24. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
  25. Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
  26. Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
  27. Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
  28. Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhang, C., Cui, M., Cui, Y., Hettinghouse, A., Liu, C. A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction. J. Vis. Exp. (150), e59656, doi:10.3791/59656 (2019).

View Video