Um ensaio de estabilidade de alvo responsivo de afinidade de drogas semiquantitativa (DARTS) para o estudo da interação Rapamycin/mTOR
Summary
Neste estudo, aprimoramos as capacidades de análise de dados do experimento DARTS, monitorando as mudanças na estabilidade protéica e Estimando a afinidade das interações proteína-ligand. As interações podem ser plotadas em duas curvas: uma curva proteolítica e uma curva de dependência de dose. Nós usamos a interação de mTOR-Rapamycin como um caso exemplar.
Abstract
A estabilidade do alvo responsivo da afinidade da droga (dardos) é um método robusto para a deteção de alvos pequenos novos da proteína da molécula. Pode ser usado para verificar interações pequenas conhecidas da molécula-proteína e encontrar alvos potenciais da proteína para produtos naturais. Comparado com outros métodos, DARTS usa moléculas nativas, não modificadas, pequenas e é simples e fácil de operar. Neste estudo, aprimoramos ainda mais as capacidades de análise de dados do experimento DARTS, monitorando as mudanças na estabilidade protéica e Estimando a afinidade das interações proteína-ligand. As interações proteína-ligantes podem ser plotadas em duas curvas: uma curva proteolítica e uma curva de dependência de dose. Nós usamos a interação de mTOR-Rapamycin como um exemplo exemplar para o estabelecimento de nosso protocolo. A partir da curva proteolítica, vimos que a proteólise do mTOR por soros foi inibida pela presença de rapamicina. A curva dose-dependência nos permitiu estimar a afinidade de ligação da rapamicina e do mTOR. Este método é susceptível de ser um método poderoso e simples para identificar com precisão novas proteínas-alvo e para a otimização do engajamento alvo de drogas.
Introduction
Identificar proteínas-alvo de pequenas moléculas é essencial para a compreensão mecanicista e o desenvolvimento de potenciais fármacos terapêuticos1,2,3. A cromatografia de afinidade, como método clássico para identificar as proteínas-alvo de pequenas moléculas, produziu bons resultados4,5. No entanto, este método tem limitações, em que a modificação química de pequenas moléculas geralmente resulta em especificidade ou afinidade de ligação reduzida ou alterada. Para superar essas limitações, várias novas estratégias foram recentemente desenvolvidas e aplicadas para identificar os alvos de pequenas moléculas sem a modificação química das pequenas molécula. Estes métodos diretos para a identificação do alvo de moléculas pequenas Label-Free incluem a estabilidade de alvo responsiva da afinidade da droga (dardos)6, estabilidade das proteínas das taxas de oxidação (SPROX)7, ensaio térmico celular do deslocamento (cetsa)8 ,9, e perfil térmico do proteoma (TPP)10. Estes métodos são altamente vantajosos porque usam moléculas pequenas naturais, não modificadas e confiam somente em interações diretas da ligação para encontrar proteínas do alvo11.
Entre esses novos métodos, dardos é uma metodologia comparativamente simples que pode ser facilmente adotada pela maioria dos laboratórios12,13. O DARTS depende do conceito de que as proteínas ligadas ao ligand demonstram suscetibilidade modificada à degradação enzimática em relação às proteínas não acopladas. A nova proteína alvo pode ser detectada pelo exame da faixa alterada em gel de SDS-PAGE através de cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS/MS). Esta abordagem tem sido implementada com sucesso para identificação de alvos previamente desconhecidos de produtos naturais e drogas14,15,16,17,18, 19. também é poderoso como um meio de tela ou validar a ligação de compostos a uma proteína específica20,21. Neste estudo, apresentamos uma melhoria no experimento, monitorando as mudanças na estabilidade protéica com pequenas moléculas e identificando afinidades vinculativas de proteínas ligantes. Utilizamos a interação mTOR-rapamicina como exemplo para demonstrar nossa abordagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
O DARTS permite a identificação de alvos pequenos da molécula explorando o efeito protetor da ligação da proteína de encontro à degradação. DARDOS não requer qualquer modificação química ou imobilização da pequena molécula26. Isto permite que as moléculas pequenas sejam usadas para determinar seus alvos de ligação direta da proteína. Os critérios de avaliação padrão para o método clássico dos dardos incluem a mancha do gel, a espectrometria maciça e o western blotting<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte por concessões da pesquisa de NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, e uma concessão da pesquisa de DOD W81XWH-16-1-0482.
Materials
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
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