Summary

Un ensayo semicuantitativo de estabilidad de objetivos sensibles a la afinidad de drogas (DARTS, por sus) para estudiar la interacción con Rapamicina/mTOR

Published: August 27, 2019
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Summary

En este estudio, mejoramos las capacidades de análisis de datos del experimento DARTS mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de las proteínas y la estimación de la afinidad de las interacciones proteína-ligand. Las interacciones se pueden trazar en dos curvas: una curva proteolítica y una curva de dependencia de dosis. Hemos utilizado la interacción mTOR-rapamicina como un caso ejemplar.

Abstract

La estabilidad de objetivos sensibles a la afinidad de fármacos (DARTS) es un método robusto para la detección de nuevos objetivos de proteínas de moléculas pequeñas. Se puede utilizar para verificar las interacciones molécula-proteína seres(as) conocidas y para encontrar posibles dianas proteicas para productos naturales. En comparación con otros métodos, DARTS utiliza moléculas nativas, no modificadas, pequeñas y es simple y fácil de operar. En este estudio, mejoramos aún más las capacidades de análisis de datos del experimento DARTS mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de las proteínas y la estimación de la afinidad de las interacciones proteína-ligand. Las interacciones proteína-ligand se pueden trazar en dos curvas: una curva proteolítica y una curva de dependencia de dosis. Hemos utilizado la interacción mTOR-rapamicina como un caso ejemplar para el establecimiento de nuestro protocolo. De la curva proteolítica vimos que la proteólisis de mTOR por pronasa fue inhibida por la presencia de rapamicina. La curva de dependencia de dosis nos permitió estimar la afinidad vinculante de rapamicina y mTOR. Es probable que este método sea un método potente y sencillo para identificar con precisión nuevas proteínas diana y para la optimización de la participación objetivo de fármacos.

Introduction

La identificación de proteínas diana de moléculas pequeñas es esencial para la comprensión mecanicista y el desarrollo de fármacos terapéuticos potenciales1,2,3. La cromatografía de afinidad, como método clásico para identificar las proteínas diana de moléculas pequeñas, ha dado buenos resultados4,5. Sin embargo, este método tiene limitaciones, en que la modificación química de moléculas pequeñas a menudo resulta en una especificidad o afinidad de unión reducida o alterada. Para superar estas limitaciones, recientemente se han desarrollado y aplicado varias estrategias nuevas para identificar los objetivos de moléculas pequeñas sin modificación química de las moléculas pequeñas. Estos métodos directos para la identificación diana de moléculas pequeñas sin etiquetas incluyen la estabilidad objetivo sensible a la afinidad de los fármacos (DARTS)6, la estabilidad de las proteínas a partir de las tasas de oxidación (SPROX)7, el ensayo de cambio térmico celular (CETSA)8 ,9, y perfilado de proteome térmico (TPP)10. Estos métodos son muy ventajosos porque utilizan moléculas pequeñas naturales y no modificadas y dependen únicamente de interacciones de unión directa para encontrar proteínas objetivo11.

Entre estos nuevos métodos, DARTS es una metodología comparativamente simple que puede ser fácilmente adoptada por la mayoría de los laboratorios12,13. DARTS depende del concepto de que las proteínas ligadas a ligando de ligando demuestran la susceptibilidad modificada a la degradación enzimática en relación con las proteínas no unidas. La nueva proteína diana se puede detectar mediante el examen de la banda alterada en gel SDS-PAGE a través de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS/MS). Este enfoque se ha implementado con éxito para la identificación de objetivos previamente desconocidos de productos naturales y medicamentos14,15,16,17,18, 19. También es potente como medio para detectar o validar la unión de compuestos a una proteína específica20,21. En este estudio, presentamos una mejora en el experimento mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de proteínas con moléculas pequeñas y la identificación de afinidades de unión proteína-ligand. Utilizamos la interacción mTOR- rapamicina como ejemplo para demostrar nuestro enfoque.

Protocol

1. Recoger y lijar células Cultivar células 293T usando el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal, 2 mM de glutamina y 1% de antibióticos. Incubar cultivos a 37oCpor debajo del 5% de CO 2.NOTA: El estado de crecimiento de las celdas puede afectar a la estabilidad de los experimentos posteriores. Amplíe las celdas en el cultivo hasta que alcancen la confluencia del 80-u201290%. Mezclar 345 ml de reactivo de lisis celular (ver la Ta…

Representative Results

El diagrama de flujo del experimento se describe en la Figura1. El resultado de la tinción azul de Coomassie se muestra en la Figura2. La incubación con la molécula pequeña confiere protección contra la proteólisis. Se encuentran tres bandas que parecen estar protegidas por la incubación con rapamicina sobre el control del vehículo. Los resultados esperados del experimento de curva proteolítica se muestran en la Figura3. Co…

Discussion

DARTS permite la identificación de pequeñas dianas de moléculas explotando el efecto protector de la unión a proteínas contra la degradación. DARTS no requiere ninguna modificación química o inmovilización de la molécula pequeña26. Esto permite utilizar moléculas pequeñas para determinar sus objetivos de proteína de unión directa. Los criterios de evaluación estándar para el método Clásico DARTS incluyen la tinción de gel, espectrometría de masas y la hincha occidental<sup cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado en parte por las becas de investigación DE NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, y una beca de investigación del Departamento de Defensa W81XWH-16-1-0482.

Materials

100X Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Dilute to 20X with ultrapure water
293T cell line ATCC CRL-3216 DMEM medium with 10% FBS
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher 23225
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Cell scraper Thermo Fisher 179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution Bio-Rad 1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma-Aldrich D2650
GraphPad Prism GraphPad Software Version 6.0 statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52 image processing and analysis software
M-PER Cell Lysis Reagent Thermo Fisher 78501
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning R21-040-CV
Pronase Roche PRON-RO 10 mg/ml
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium fluoride Sigma-Aldrich S7920
Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich 450243
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich 221368
Trizma base Sigma-Aldrich T1503 adjust to pH 8.0
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

References

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Zhang, C., Cui, M., Cui, Y., Hettinghouse, A., Liu, C. A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction. J. Vis. Exp. (150), e59656, doi:10.3791/59656 (2019).

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