Denne protokol beskriver en meget følsom og høj overførselshastighed neutrofile ekstracellulære fælde (NET) assay for semi-automatiske kvantificering af ex vivo nettet formation ved immunfluorescens tredimensionale Konfokal mikroskopi. Denne protokol kan bruges til at evaluere netto dannelse og nedbrydning efter forskellige stimuli og kan bruges til at undersøge potentielle NET-målrettede behandlinger.
Neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) er immunogen ekstracellulære DNA strukturer, som kan udledes af neutrofiler ved en bred vifte af udløsere. Net har vist sig for at fungere som en vigtig vært forsvarsmekanisme, der fælder og dræber mikroorganismer. På den anden side har de været involveret i forskellige systemiske autoimmune sygdomme. NETs er immunogen og giftige strukturer, der indeholder en pulje af relevante autoantigens, herunder anti-neutrofile cytoplasmatisk antistoffer (ANCA)-forbundet vaskulitis (AAV) og systemisk lupus erythematosus (SLE). Forskellige former for redskaber kan være fremkaldt afhængigt af stimulus. Mængden af redskaber kan kvantificeres ved hjælp af forskellige teknikker, herunder måling af DNA udgivelse i supernatanter, måling af DNA-kompleksbundet med NET-molekyler som myeloperoxidase (MPO) eller neutrofile elastase (NE), måling af tilstedeværelsen af citrullinated histoner af Fluorescens mikroskopi eller flow cytometric påvisning af NET-komponenter, som alle har forskellige karakteristika med hensyn til deres specificitet, sensitivitet, objektivitet og mængde. Her er en protokol til at kvantificere ex vivo NET dannelse i en yderst følsom, høj overførselshastighed måde ved hjælp af tre-dimensionelle immunofluorescens Konfokal mikroskopi. Denne protokol kan anvendes for at løse forskellige forskningsspørgsmål om netto dannelse og nedbrydning i sundhed og sygdom.
Dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) er den proces, hvor neutrofiler frigive deres DNA i en ekstracellulære tredimensionale (3D) web-lignende struktur, kompleksbundet med en bred vifte af antimikrobielle og farlige molekyler, granulerede og cytoplasmatisk enzymer, peptider og proteiner. Disse immunogen og giftige strukturer har en fysiologisk rolle i medfødte immun forsvaret af raske personer ved fældefangst og dræbe smittefarlige patogener1. De har imidlertid også påvist for at være involveret i trombose2 og forskellige systemiske autoimmune sygdomme, herunder anti-neutrofile cytoplasmatisk antistoffer (ANCA)-forbundet vaskulitis (AAV)3, systemisk lupus erythematosus (SLE )4,5, antiphospholipid syndrom (APS)2,6, leddegigt (RA), psoriasis og gigt7,8,9.
In vitro netto dannelse er blevet bredt undersøgt med det kemiske stof phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), der inducerer massive netto dannelse. Men mest fysiologiske stimuli fremkalde meget lavere niveauer af netto dannelse10. Til undersøgelse NET-udløsere i, for eksempel, en autoimmun sygdom indstilling, en standardiseret, følsomme, høj overførselshastighed kvantitative analyse er nødvendig for at påvise og kvantificere netto dannelse. Kvantificering af NETs har vist sig for at være en udfordring og er i øjeblikket udføres af forskellige metoder, hver med deres egen fordele og begrænsninger11. En almindeligt anvendt metode er påvisning af DNA i supernatanter12, som er mål, men ikke diskriminerer mellem oprindelsen af DNA (apoptotiske, nekrotisk, garn), og er derfor ikke meget specifikke for net. For det andet enzym-forbundet immunosorbent assays (ringprøver) af DNA-kompleksbundet med NET-specifikke proteiner, f.eks myeloperoxidase (MPO) eller neutrofile elastase (NE), er en mere specifik tilgang til at opdage redskaber og blev vist sig for at korrelere godt med citrullinated Histon-3 (CitH3) positiv net13. Det vides dog ikke, om denne metode er følsom nok til at afhente alle redskaber (fx, MPO, NE, og CitH3 negative net). En tredje metode er immunofluorescens mikroskopi, der bruges til at påvise Co lokalisering af NET-associerede molekyler (NE, MPO, CitH3) med ekstracellulære DNA til at kvantificere net. Denne metode er generelt specifikke for net, men det kan ikke anvendes som en høj overførselshastighed metode og er ikke mål på grund af observatør bias. Desuden, tager denne metode ikke hensyn MPO-, NE-, CitH3-negative redskaber, der findes hyppigt afhængigt af den anvendte NET-trigger14,15. Flow flowcytometri tilgange opdage net gennem en ændret fremad/sidelæns scatter (FSC/SSC) med angivelse af hævelse af kernen i NET-Tinget neutrofiler16. Denne metode tager ikke hensyn til de forskellige former for NET formation, som er blevet identificeret, som ikke kan medføre hævelse af kernen, som vital netto dannelse17. Endelig er immunofluorescens Konfokal mikroskopi blevet anvendt for at visualisere og kvantificere netto dannelsen af direkte farvning ekstracellulære DNA med en celle-vandtætte farvestof, der pletter ekstracellulære DNA12,18. Generelt er 5 til 10 high-power felter manuelt plukket og vurderet, som dækker 1-5% af hver godt en 96-brønd plade11,17. Manuel udvælgelse af billeder er ikke altid objektive, tilbøjelige til bias og ikke attraktivt for høj overførselshastighed analyse. En automatiseret, høj overførselshastighed netto kvantificering assay blev for nylig udviklet, som afbildet 11% af brønden i 3D måde dækker 13 µm gennem Z-stacked immunofluorescens Konfokal mikroskopi, hvilket vil føre til en yderst følsom teknik at vurdere net sammenlignet med konventionelle metoder10. Den aktuelle rapport beskriver den seneste protokol for at kvantificere netto dannelse gennem en automatiseret, yderst følsom analyse ved hjælp af 3D Konfokal mikroskopi, som opnår en samlet afbildet areal på 45% af hver brønd og dækker 27 µm gennem Z-stakke. Denne protokol er egnet til at kvantificere, med en høj følsomhed, lave niveauer af netto dannelse i en objektiv og upartisk måde.
Den mest kritiske del af denne analyse er behovet for at bruge frisk isolerede neutrofiler til hvert eksperiment, fordi neutrofile er kortvarig og dø når frosne. Dette kræver en sund donor hver gang, som kunne belaste nogle variationer på grund af donor karakteristika. En af disse variationer er aktivisering statussen i neutrofile. Neutrofiler kan aktiveres allerede in vivo før isolation. Derudover neutrofiler kan aktiveres i hele isolation trin navnlig under lysering af erytrocytter, derfor en erfaren handler af neutrofiler er påkrævet for at minimere aktivering af neutrofile. I almindelighed, isolation af neutrofiler bør udføres hurtigst muligt efter blod tegne og forsøget bør ikke afbrydes midlertidigt for at undgå overdreven spontan aktivering. For det andet bør hårdhændet behandling af neutrofiler undgås. Som sådan, er bemærkelsesværdige fordelen ved den beskrevne protokol minimal pipettering interventionerne når neutrofiler udsås i en 96-brønd plade. Vigtigere, er aktivisering statussen i neutrofile bedst vurderet i den unstimulated tilstand, hvori dette assay kan nænsomt opdage lave niveauer af netto dannelse. En anden faktor, der kan påvirke analysen er brugen af FCS i mediet. Procentdelen af FCS er faldet fra 10% til 2% for at undgå mulige undertrykkelse af netto dannelsen af antioxidant aktivitet19,20 eller mulige aktivering af neutrofile trods varmen inaktivering. Kultur uden FCS eller bruge forskellige typer af medier har ikke blevet prøvet. En unstimulated eller mellemlang kontrol er altid taget langs når du udfører analysen til at have en indikation af baggrunden signal (f.eks., aktivisering status i neutrofile). Fold stigning for hver stimulus i forhold til den unstimulated prøve vises for at opnå ensartede resultater over forskellige eksperimenter ved hjælp af den samme stimulus.
En vigtig faktor for et muligt høj baggrund farvning af ekstracellulære DNA, der er relateret til processen med netto dannelse. Den foreliggende analyse forsøger at reducere dette ved at fjerne den ekstracellulære DNA farvning umiddelbart efter den korte inkubationstiden 15 min. og ved at analysere pladen direkte efter fiksering. Derfor er det vigtigt at anvende en avanceret Konfokal mikroskop, der har nok hastighed og analytisk magt til at fange den 96-brønd plade inden for 1 til 2 h. automatiseret indstilling af eksponeringstid og fokus kan anbefales. Som sådan, kan indstillingen mikroskop varierer mellem hver prøve og eksperimentere med hensyn til farve intensitet grænseværdi, som er nødvendige for samlet optimal billedkvalitet. De sidstnævnte påvirkninger den eventuelle evne til korrekt kvantificere neutrofile og redskaber og den optimale indstilling skal derfor bekræftes ved hjælp af flere kontrolprøver (fx serum sund kontrol). Under analysen af optagne billeder, brugen af en pixel tærskel og størrelse tærskel i programmet analyse giver mulighed for en bedre udvalg af NET dannelse.
Ekstracellulære DNA stammer fra netto dannelse kan være resultatet af forskellige død veje, herunder NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis eller endog ikke-lytisk proces af vitale netto dannelse1. Som sådan, er en begrænsning af den nuværende assay, at ved farvning kun for ekstracellulære DNA der er ingen differentiering mellem netto dannelse og andre relevante celle død veje. Det er muligt at opnå dette ved hjælp af enten selektiv hæmmere af særskilte død veje til at diskriminere mellem de forskellige former for netto dannelse eller bekræfte af separate immunostainings tilstedeværelsen af specifikke NET markører, såsom citH3 og NE, Co lokaliseret med DNA. Co lokaliseringen af ekstracellulære DNA med citH3 og NE er for nylig blevet bekræftet i denne analyse10. Fordelen ved at undgå netto specifikke markører i denne analyse, giver mulighed for at vurdere alle former for netto dannelse fører til ekstrudering af DNA af neutrofiler som komplet og så objektiv som muligt med potentialet i high throughput screening. Anvendeligheden af denne protokol har vist sig at studere lav niveau netto induktion medieret af immunkomplekser i auto-immun sygdom, hvor evnen til at opdage kvalitative og kvantitative forskelle kan være vigtigere end typen proces involverede10,21,22. Illustrerer, at denne roman netto kvantificering assay kan være af merværdi for forskellige forskere til at undersøge forskellige aspekter af netto dannelse. Små justeringer til analysen gennemføres let: justering af perioden stimulation, brugen af en favorit netto markør til at fokusere på én bestemt død vej fører til netto dannelse, brug af forskellige forstørrelse eller brugen af forskellige NET kriterier i kvantificering og analyse.
Afslutningsvis er protokollen i henhold en yderst følsomme bredt gældende assay for semi-automatiske kvantificering af netto dannelse evaluering af ex vivo induktion af net på forskellige stimuli.
The authors have nothing to disclose.
Eline J. Arends og Y.K. Onno Teng arbejde støttes af den nederlandske nyre Foundation (17OKG04), klinisk Fellowship fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (90713460). Laura S. van Dams arbejde støttes af fonden for forskning i reumatologi (FOREUM).
Aqua Sterile H2O | B. Braun, Melsungen, Germany | 12604052 | |
Fetal bovine serum (FCS) | Bodinco, Alkmaar, The Netherlands | Used in high concentrations it could influcence NET formation | |
Ficoll 5,7% – amidotrizoaat 9% density 1,077 g / mL | LUMC, Leiden, The Netherlands | 97902861 | |
Immunofluorescence confocal microscope | Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) | ||
Neutralization PBS (10x) | Gibco, Paisley, UK | 70011-036 | |
Penicillin / streptomycin (p/s) | Gibco, Paisley, UK | 15070063 | |
Phenol red free RPMI 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 11835-063 | Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal |
Phosphate-buffered saline (PBS) | B. Braun, Melsungen, Germany | 174628062 | |
PKH26 2 uM Red fluorescent cell linker | Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA | PKH26GL-1KT | PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan |
Program for scientific multidimensional images analysis | ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | ||
RPMI medium 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 52400-025 | |
Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye | Gibco, Paisley, UK | 57020 | |
Trypan blue stain 0,4% | Sigma Aldrich, Germany | 17942E | |
96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate | Falcon, NY, USA | 353219 |