مقايسة الفائق تقييم وتقدير حجم تشكيل العَدلات فخ خارج الخلية
Summary
ويصف هذا البروتوكول مقايسة فخ خارج الخلية العَدلات (صافي) حساسة للغاية وعالية إنتاجية للتحديد الكمي شبه الآلي للسابقين تشكيل فيفو نت التي الفلورة مجهرية [كنفوكل] ثلاثي الأبعاد. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتقييم تكوين الصافية وتدهور بعد المحفزات المختلفة، ويمكن استخدامها لدراسة العلاجات المحتملة المستهدفة للشبكة.
Abstract
الفخاخ خارج الخلية العَدلات (شبكات) هي مكسبه هياكل الحمض النووي خارج الخلية التي يمكن إصدارها من قبل العَدلات على مجموعة متنوعة واسعة من المشغلات. لقد ثبت شباك لتكون بمثابة إليه للدفاع مهمة مضيف الفخاخ ويقتل الكائنات الحية الدقيقة. من ناحية أخرى، قد تورطت في أمراض المناعة الذاتية جهازية متنوعة. شبكات هي هياكل مكسبه والسامة التي تحتوي على مجموعة أوتوانتيجينس ذات الصلة بما في ذلك الأجسام المضادة نيوتروفيل هيولى (ANCA)-المرتبطة التهاب الأوعية الدموية (إف) والذئبة الحمامية الجهازية (SLE). يمكن الناجمين عن أشكال مختلفة من شبكات اعتماداً على التحفيز. مقدار شبكات يمكن قياسها كمياً باستخدام تقنيات مختلفة بما في ذلك قياس الإفراج عن الحمض النووي في supernatants، قياس الحمض النووي-الرصاصية مع الصافي بين الجزيئات مثل ميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات) أو elastase العَدلات (شمال شرق)، قياس وجود سيتروليناتيد هيستونيس المجهري الأسفار، أو تدفق سيتوميتريك الكشف عن مكونات شبكة لها كلها من ميزات مختلفة فيما يتعلق بخصوصية وحساسية، والموضوعية، وكمية. هنا بروتوكول تحديد مقدار السابقين تشكيل فيفو نت بطريقة حساسة للغاية، والفائق باستخدام مجهر الفلورة ثلاثي الأبعاد [كنفوكل]. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لمعالجة مختلف مسائل البحث عن تكوين NET وتدهور في الصحة والمرض.
Introduction
تشكيل الفخاخ خارج الخلية العَدلات (شبكات) هو العملية التي العَدلات الإفراج عن عينات من الحمض النووي في شبكة (3D) ثلاثي الأبعاد خارج الخلية مثل هيكل، الرصاصية مع مجموعة واسعة من الجزيئات المضادة للميكروبات والخطرة، الحبيبية و هيولى الإنزيمات، الببتيدات والبروتينات. هذه الهياكل مكسبه والسامة دوراً هاما فسيولوجية في الدفاع المناعي الفطري للأشخاص الأصحاء بمحاصرة وقتل مسببات الأمراض المعدية1. بيد أنهم قد أثبتت أيضا أن تشارك في تجلط الدم2 ومختلف أمراض المناعة الذاتية الشاملة، بما في ذلك الأجسام المضادة نيوتروفيل هيولى (ANCA)-المرتبطة التهاب الأوعية الدموية (إف)3، الذئبة الحمامية الجهازية (SLE )4،5،2،متلازمة الفوسفولبيد (الجزائرية)6والتهاب المفاصل الرثياني (RA)، والصدفية والنقرس7،،من89.
ودرست تشكيل الصافي في المختبر على نطاق واسع phorbol المركب الكيميائي 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)، مما يؤدي إلى تشكيل شبكة واسعة النطاق. لكن معظم المنبهات الفسيولوجية الحث على مستويات أقل بكثير من تشكيل الصافي10. لدراسة صافي-المشغلات في، على سبيل المثال، وضع أمراض المناعة الذاتية، مطلوب مقايسة كمية موحدة، حساسة، الفائق لكشف وتحديد تشكيل صافي. التحديد الكمي لشبكات قد ثبت أن التحدي وتتم حاليا بأساليب مختلفة، كل منها11المزايا والقيود الخاصة بها. هو أسلوب المستخدمة عادة الكشف عن الحمض النووي في supernatants12، الذي هو الهدف ولكن لا تميز بين الأصل من الحمض النووي (apoptotic، نخرية، شبكات)، وبالتالي فليس محددة جداً لشبكات. ثانيا، يتم اتباع نهج أكثر تحديداً للكشف عن شبكات فحوصات المرتبط بالانزيم المرتبط (الساس) من الحمض الرصاصية مع البروتينات الخاصة بالشبكة، على سبيل المثال، ميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات) أو elastase العَدلات (شمال شرق)، وأظهرت ترتبط كذلك سيتروليناتيد هيستون-3 (CitH3) إيجابية شباك13. بيد أنه لا يعرف ما إذا كان هذا الأسلوب حساسة بما يكفي لالتقاط جميع الشباك (مثل الخطة الرئيسية للعمليات، ني، وشبكات CitH3 السلبية). وثمة نهج ثالث هو مجهر الفلورة المستخدمة للكشف عن التعريب المشارك من الجزيئات المرتبطة بالشبكة (NE، الخطة الرئيسية للعمليات، CitH3) مع الحمض النووي خارج الخلية لتحديد شبكات. هذا الأسلوب عموما محددة للشباك، ولكن لا يمكن تطبيقه كأسلوب الفائق، وليس الهدف بسبب التحيز المراقب. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب لا تأخذ في الاعتبار الخطة الرئيسية للعمليات-، ني-، شبكات CitH3 السلبية التي تكون موجودة غالباً تبعاً لمشغل الشبكة المستخدمة14،15. التدفق الخلوي نهج الكشف عن شبكات من خلال تغير الأمام/سيديوارد مبعثر (منتدى التعاون الأمني/SSC) تشير إلى تورم النواة في صافي-تينغ العَدلات16. هذا الأسلوب لا تراعي الأشكال المختلفة لتشكيل الصافية التي تم تحديدها، مما قد لا تشمل تورم النواة، مثل تشكيل شبكة حيوية17. وأخيراً، طبق مجهرية [كنفوكل] الفلورة تصور وتحديد تشكيل الصافية تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية مع صبغة خلية كتيمة البقع12،الحمض النووي خارج الخلية18مباشرة. عموما، 5 إلى 10 حقول عالية الطاقة يدوياً اختار وتقييمها، الذي يغطي 1-5% من كل بئر من11،لوحة 96-كذلك17. دليل اختيار الصور ليست دائماً موضوعية وعرضه للتحيز وغير جذابة للتحليل الفائق. تحليل الكمي صافية مؤتمتة، الفائق وضعت مؤخرا، تصويرها 11% البئر بطريقة ثلاثية الأبعاد تغطي 13 ميكرون من خلال الفحص المجهري [كنفوكل] الفلورة مكدسة Z، مما يؤدي إلى تقنية حساسة للغاية لتقييم شبكات بالمقارنة مع الأساليب التقليدية10. ويصف التقرير الحالي البروتوكول الأكثر حداثة للتحديد الكمي لتشكيل صافية من خلال مقايسة الآلي، حساسة للغاية استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] ثلاثية الأبعاد، مما يحقق المصورة مساحة إجمالية قدرها 45 في المائة من كل بئر ويغطي 27 ميكرون من خلال Z-مداخن. هذا البروتوكول مناسبة للقياس الكمي، مع حساسية عالية، مستويات منخفضة من تشكيل الصافي بطريقة غير متحيزة والهدف.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجزء الأكثر أهمية من هذا التحليل هو ضرورة استخدام العَدلات طازجة معزولة لكل تجربة لأن العَدلات لم تدم طويلاً ويموت عندما جمدت. وهذا يتطلب من المانحين صحي كل الوقت، والتي يمكن أن توريط بعض الاختلافات بسبب خصائص الجهات المانحة. واحدة من هذه الاختلافات هي حالة التنشيط العَدلات. يمكن تنشيط العَدلات في المجراة قبل عزلة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تفعيل العَدلات طوال خطوات العزل لا سيما أثناء تحلل الكريات الحمراء، ولذلك مطلوب معالج ذوي خبرة من العَدلات للتقليل من تفعيل العَدلات. وبصفة عامة، ينبغي أن يجري عزل العَدلات وقت ممكن بعد الدم الرسم والتجربة لا ينبغي أن يكون مؤقتاً لتجنب التنشيط العفوية المفرطة. وثانيا، ينبغي تجنب معالجة الخام من العَدلات. على هذا النحو، هو ميزة ملحوظة لبروتوكول وصف التدخلات بيبيتينج الحد الأدنى مرة واحدة هي تبذر العَدلات في صفيحة 96-جيدا. الأهم من ذلك، هو أفضل تقييم حالة التنشيط العَدلات في حالة أونستيمولاتيد، الذي كشف هذا التحليل يمكن حس مرهف مستويات منخفضة من تشكيل صافي. العوامل الأخرى التي يمكن أن تؤثر في التحليل هو استخدام FCS في الأجل المتوسط. النسبة المئوية السفح قد انخفضت من 10% إلى 2% لتجنب إمكانية قمع تشكيل صافي المضادة للأكسدة النشاط19،20 أو إمكانية تنشيط العَدلات على الرغم من الحرارة المنظمة. لم يحاكم الثقافة دون FCS أو باستخدام أنواع مختلفة من وسائل الإعلام. عنصر تحكم أونستيمولاتيد أو المتوسط تتخذ دائماً على طول عند القيام الفحص أن يكون مؤشرا لإشارة المعلومات الأساسية (مثل حالة التنشيط، من العَدلات). يتم عرض زيادة إضعاف لكل الحوافز مقارنة بالعينة unstimulated تحقيق نتائج متسقة عبر تجارب مختلفة باستخدام نفس الحافز.
هو تلطيخ عاملاً هاما لخلفية ارتفاع ممكن للحمض النووي خارج الخلية التي لا صلة لها بعملية تشكيل صافي. التحليل الحالي محاولات للحد من هذا عن طريق إزالة تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية مباشرة بعد فترة الحضانة قصيرة من 15 دقيقة وتحليل اللوحة مباشرة بعد التثبيت. ولذلك، من الضروري أن تستخدم مجهر [كنفوكل] متقدمة التي لديها ما يكفي من السرعة والقوة التحليلية لالتقاط لوحة 96-جيدا داخل 1 إلى 2 حاء الآلي من المستحسن استخدام الإعداد من وقت التعرض والتركيز. على هذا النحو، يمكن أن تختلف بين كل عينة الإعداد المجهر والتجربة فيما يتعلق بعتبة كثافة اللون هو أمر ضروري لجودة الصورة المثلى عموما. تأثيرات هذه الأخيرة ولذلك ينبغي تأكيد القدرة في نهاية المطاف كمياً بشكل صحيح العَدلات والشباك والإعداد الأمثل باستخدام عينات مراقبة متعددة (مثل مصل لضوابط صحية). أثناء تحليل الصور الملتقطة، يتيح استخدام عتبة بكسل وحجم الحد الفاصل في برنامج تحليل لاختيار أفضل من تشكيل الصافية.
الحمض النووي خارج الخلية المستمدة من تشكيل صافي يمكن أن يكون نتيجة لمسارات الموت متميزة، بما في ذلك نيتسيس، نيكروبتوسيس، بيروبتوسيس، فيروبتوسيس أو حتى غير الحال عملية تشكيل شبكة حيوية1. على هذا النحو، حد من تحليل هذا أن يوجد تلطيخ فقط للحمض النووي خارج الخلية أي تمييز ممكن بين تشكيل الصافية ومسارات موت الخلية ذات الصلة الأخرى. من الممكن تحقيق ذلك عن طريق استخدام أما مثبطات انتقائية لمسارات الموت متميزة بتميز بين الأشكال المختلفة التي تدعم تشكيل الصافية أو تأكيد وجود علامات صافي محددة، مثل citH3 وني، قبل إيمونوستينينجس منفصلة شارك المترجمة مع الحمض النووي. وأكدت مؤخرا التعريب المشارك من الحمض النووي خارج الخلية مع citH3 وني لهذا الإنزيم10. ميزة تجنب صافي علامات محددة في هذا التحليل، يسمح بتقييم صافي تشكيل مما أدى إلى قذف الحمض النووي من العَدلات كاملة وموضوعية بقدر الإمكان مع إمكانية الفرز الفائق بجميع أشكاله. وقد تبين مدى انطباق هذا البروتوكول في دراسة التعريفي صافي مستوى منخفض بمجمعات محصنة في أمراض المناعة الذاتية القدرة على الكشف عن الاختلافات النوعية والكمية التي قد يكون أكثر أهمية من نوع عملية وساطة تشارك10،،من2122. توضح أن هذا التحليل الكمي صافي رواية يمكن أن تكون القيمة المضافة لمختلف الباحثين للتحقيق في الجوانب المختلفة لتشكيل شبكة. تعديلات صغيرة للمقايسة وتنفذ بسهولة: تعديل فترة التحفيز أو استخدام علامة صافي المفضلة لديك للتركيز على مسار الموت محددة واحدة مما أدى إلى تشكيل شبكة أو استخدام التكبير المختلفة أو استخدام معايير مختلفة صافية في القياس الكمي والتحليل.
وفي الختام، وينص البروتوكول مقايسة المطبقة على نطاق واسع حساسة للغاية للتحديد الكمي شبه الآلي لتشكيل الصافية للتقييم السابقين فيفو الاستقراء من الشباك على محفزات مختلفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
عمل الين J. عرندس وتنغ أونو مجموعة تدعمها “مؤسسة الكلي الهولندية” (17OKG04)، الزمالة السريرية من “منظمة هولندا” “البحث العلمي” (90713460). العمل لورا س. فإن دام معتمد من قبل مؤسسة البحوث في “أمراض الروماتيزم” (دعت).
Materials
| Aqua Sterile H2O | B. Braun, Melsungen, Germany | 12604052 | |
| Fetal bovine serum (FCS) | Bodinco, Alkmaar, The Netherlands | Used in high concentrations it could influcence NET formation | |
| Ficoll 5,7% – amidotrizoaat 9% density 1,077 g / mL | LUMC, Leiden, The Netherlands | 97902861 | |
| Immunofluorescence confocal microscope | Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) | ||
| Neutralization PBS (10x) | Gibco, Paisley, UK | 70011-036 | |
| Penicillin / streptomycin (p/s) | Gibco, Paisley, UK | 15070063 | |
| Phenol red free RPMI 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 11835-063 | Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | B. Braun, Melsungen, Germany | 174628062 | |
| PKH26 2 uM Red fluorescent cell linker | Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA | PKH26GL-1KT | PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan |
| Program for scientific multidimensional images analysis | ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | ||
| RPMI medium 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 52400-025 | |
| Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye | Gibco, Paisley, UK | 57020 | |
| Trypan blue stain 0,4% | Sigma Aldrich, Germany | 17942E | |
| 96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate | Falcon, NY, USA | 353219 |
References
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 151-164 (2017).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases?. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Garcia-Romo, G. S., et al. Netting neutrophils are major inducers of type I IFN production in pediatric systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra20 (2011).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra19 (2011).
- Meng, H., Yalavarthi, S., et al. In Vivo Role of Neutrophil Extracellular Traps in Antiphospholipid Antibody-Mediated Venous Thrombosis. Arthritis & Rheumatology. 69 (3), 655-667 (2017).
- Desai, J., et al. Particles of different sizes and shapes induce neutrophil necroptosis followed by the release of neutrophil extracellular trap-like chromatin. Scientific Reports – Nature. 7 (1), 15003 (2017).
- Desai, J., et al. PMA and crystal-induced neutrophil extracellular trap formation involves RIPK1-RIPK3-MLKL signaling. European Journal of Immunology. 46 (1), 223-229 (2016).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. , (2018).
- Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes. Autoimmunity Reviews. 15 (6), 577-584 (2016).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Nakazawa, D., et al. Enhanced formation and disordered regulation of NETs in myeloperoxidase-ANCA-associated microscopic polyangiitis. Journals of the American Society of Nephrology. 25 (5), 990-997 (2014).
- Konig, M. F., Andrade, F. A Critical Reappraisal of Neutrophil Extracellular Traps and NETosis Mimics Based on Differential Requirements for Protein Citrullination. Frontiers in Immunology. 7, 461 (2016).
- Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. Elife. 6, (2017).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. The Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888 (2014).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
- von Köckritz-Blickwede, M., Chow, O., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Kraaij, T., et al. Excessive neutrophil extracellular trap formation in ANCA-associated vasculitis is independent of ANCA. Kidney International. , (2018).
- Kraaij, T., et al. The NET-effect of combining rituximab with belimumab in severe systemic lupus erythematosus. Journal of Autoimmunity. , (2018).
- Hahn, J., Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. (Aug 21), (2018).
