Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Bütün hasta ve sağlıklı kontrol LUMC biobank katılmak için onay verdi. Her iki biobanking çalışmalar LUMC Etik Komitesi tarafından kabul edildi. 1. yalıtım sağlıklı nötrofil 20 mL periferik kan EDTA kaplı iki 10 mL tüpler sağlıklı bir donörden elde edilir. Kan 10 mL steril 50 mL tüp içinde koyun ve fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleyin 32,5 mL. Yoğunluk gradient (e.g., Ficoll-amidotrizoaat) altında hücreleri ekleyin. Yoğunluk 14 mL kadar bir 10 mL damlalıklı ve damlalıklı denetleyicisi ile degrade al. Damlalıklı 50 mL tüp dibinde yerleştirin. Maksimum kapiller etkisiyle ulaşılana kadar yerçekimi tarafından dışarı damlalıklı akmaya yoğunluk gradient izin damlalıklı denetleyicisi damlalıklı kapalı al (1-2 mL kalmamış olabilir), motor kullanmadan. Damlalıklı böylece damlalıklı kaldırılması sırasında sızıntı yoğunluk gradient önleme damlalıklı, üstüne bir başparmak koyarak kaldırın. Tüpler 20 dk 912 x g ve oda sıcaklığında (RT) hızlanma ve fren için spin.Not: Kırmızı kan hücreleri (RBC) ve nötrofil yüksek yoğunluklu ve 50 mL tüp altındadır. Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) ayrılmış ve yoğunluk gradient üstüne beyaz bir halkası olarak. PBS seyreltilmiş plazma PBMCs olacak. Gerekirse, PBMCs beyaz yüzük PBS ile ek yıkama adımlarla yeni bir 50 mL tüp aktararak izole. Dikkatli bir şekilde PBMCs önce içeren beyaz yüzük çıkarılması PBS seyreltilmiş plazma ve son olarak mümkün olduğu kadar yoğunluk degrade katman tarafından takip çıkarın. Nötrofil nötrofil/eritrositler mix dan ayırmak için eritrositler soğuk steril distile su tarafından parçalayıcı. Soğuk steril distile su şişesi al ve 10 x PBS şişe buzdolabından yoğunlaşmıştır. Hızlı bir şekilde iş için bu adım. 36 mL soğuk steril distile su doğrudan Pelet üzerine ve bir kez dikkatlice karıştırın. 10 x PBS 4 mL 20 sonra ekleyin s izotonik bir çözüm yapmak. Bir kez dikkatlice karıştırın. Tüp 5 min vasıl 739 x g ve 4 ° C (RBCs kaldırılmak) için spin. Nötrofil beyaz Pelet olacak. Dikkatle süpernatant atmak. Adım 1.6.2 yeniden uygulayın ve Pelet düzgün askıya alınır emin olun. Tüp vasıl 328 x g 5 min ve 4 ° c için spin Dikkatle süpernatant kaldırmak ve Pelet PBS 5 mL resuspend. Nötrofil sayısı ve buz üzerinde tutun.Not: Beklenen 1 tüp kan (10 mL) yaklaşık 15-75 milyon nötrofil verimidir. 2. kırmızı floresan hücre nötrofil etiketleme 10-20 milyon nötrofil nötrofil süspansiyon PBS 2 mL 15 mL tüp içinde olun. 2 mL PBS bir çözüm ile 2 µM kırmızı floresan hücre bağlayıcı 4 µL olun ( Tablo malzemelerigörmek) farklı 15 mL tüp içinde. Bu yavaşça nötrofil süspansiyon ve dikkatlice karıştırın. Karanlıkta tam olarak 25 dk 37 ° C’de nötrofil kırmızı floresan hücre bağlayıcı ile etiketlemek için kuluçkaya. RPMI 1640 orta % 10 ısı içeren fetal Sığır serum (FCS) inaktive ekleyerek RT en çok 15 mL karışımı etiketleme ve bir kez dikkatlice devre dışı. Bir Pelet oluşturmuştur Eğer Pelet dikkatli bir şekilde resuspended emin olun. Tüp 328 x g ve RT. 5 min için spin Süpernatant kaldırmak ve Pelet 5 mL RPMI 1640 fenol red-Alerjik resuspend Orta % 2 FCS ve % 10 içeren P/S RT. saymak nötrofiller.Not: Bir hücre kaybı % 50 kırmızı floresan hücre etiketleme sonra ortaya çıkabilir. 3. indüksiyon nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu Ücretsiz RPMI 1640 orta içeren % 2 FCS ve 0,42 106 hücre/mL fenol kırmızı x bir hücre süspansiyon yapmak P/S. 37.500 nötrofil siyah 96-şey, düz alt plaka bir kuyu başına 90 µL ekleyin. Seçilen uyarıcı (örneğin, hastanın sera) 10 µL % 10 iyi bir konsantrasyon ulaşmak için nüsha ekleyin. Her zaman negatif kontrol (orta) nüsha içerir. Karanlıkta 37 ° C’de 30 dk arasında değişen 2, 4 veya 6 h. kuluçka için 4 h önerilir için istenen kez kuluçkaya. Birimin 25 eklemek µL 5 µM geçirimsiz DNA’ın (bkz. Tablo reçetesi) iyi 1 µM son bir konsantrasyon ulaşmak için boya hesaplamak. Bir predilution yapmak gerekirse RPMI 1640 orta içeren % 2 FCS ve % 10 P/S 5 mikron konsantrasyonu elde edilir. 5 µM geçirimsiz DNA boya 15 dk 25 µL kuluçka süresi sona ermeden ekleyin. Karanlıkta 37 ° C’de kuluçka başka bir 15 dakika devam. Süpernatant (~ 125 µL) çok dikkatli bir şekilde çıkarın ve gerekirse saklayın. 100 µL % 4 paraformaldehyde (PFA) ekleyin. Karanlıkta bırakın ve hemen adım 4 ile devam edin. 4. NET görselleştirme ile 3D yüksek içeriği, yüksek çözünürlüklü ayirt Confocal mikroskobu Ayirt confocal mikroskobunun edinme kurulum üzerinde tıklatarak ayarlarını yapılandırır. Konfigürasyon tanımla sekmesini tıklatın. Objektif ve kamera seçeneklerini belirleyin. 10 X Apo Lambda amacı ile bir confocal 60 µm iğne deliği bir satın alma modu seçin. Plaka üzerinde tıklatın ve 96-şey Plastik tabak seçin. Ziyaret edin ve siteleri sabit bir dizi seçim için siteleri seçin. 3 sütun ve iyi % 45 toplam kapsayan 3 satır çakışma (0 µm), olmadan doldurun. Satın almaüzerinde’yi tıklatın. Lazer tabanlı odaklanarak etkinleştir’ i seçin. Z serisi/saat serisi elde etmek gerekirse seçin. Site otomatik odaklamaüzerinde’yi tıklatın. Tıklayın plaka alt odak | Off-Set alt kalınlığı tarafından. Örnek bulmak için ilk şey seçmek için ilk iyi satın aldı. Site otofokus için tüm siteleri seçin. Dalgaboyuüzerinde’yi tıklatın. Dalga boylarında numarası için 2 2 TL gölgelendirme düzeltme arıtma düzeyi için seçin. Dalga boyu 1, Texas kırmızıyı seçin. Otomatik odaklama seçenekleri, select Z ofset, laserle için lazer ofset 1.1 µm. Kullanım Z-yığını ile özel bir sıra 200-10 post. Dalga boyu 2, FITC seçin. Otomatik odaklama seçenekleri için seçin w1 Z ofset ile 0 µm. Kullanım Z-yığın 200-10 özel bir dizi ile lazer. Z serisi ve 2D projeksiyon görüntü maksimum edinme seçeneklerini seçin. Satın alma seçenekleri için gölgelendirme düzeltme seçin | Kapalı. Z Serisiseçin. Adım sayısını seçin: 10. Adım boyu seçin: 3 mm (Toplam Aralık 27 µm olacak). Plaka ayirt confocal mikroskobu koymak. Çalıştır sekmesinde tıklatın. Plaka adı ve açıklama doldurmak ve depolama konumu seçin. Elde edilebilir için ihtiyacınız wells seçin. Pozlama süresi Texas kırmızı ve FITC için seçin. Elde plaka plaka başına yaklaşık 1 saat sürer satın başlatmak için tıklatın. 5. analiz NET oluşumu Bir görüntü işleme ( Tablo malzemelerigörmek) bilimsel çok boyutlu görüntüleri analiz için NET oluşumu analiz etmek için tasarlanmış bir program kullanın. Elde edilen görüntü verilerini ayrı bir sabit diske aktarmak. Araç ekleyerek rengini seçin. W1 seçin ve belgili tanımlık sert sokmak verilerin nerede saklanacağı klasörü seçin. W2 seçin ve belgili tanımlık sert sokmak verilerin nerede saklanacağı klasörü seçin.Not: W1 kırmızı renk Texas kırmızı resimlere eklemek için dosya adını kullanan ve yeşil renk FITC görüntüler eklemek için w2 kullanan standart bir makro kullanın. Analiz makroyu seçin. W1seçin, genellikle 10 olan eşik değer (yoğunluk eşik) seçin. İstediğiniz piksel değeri (boyutu eşiğini, örneğin, 100) seçin. W2seçin, genellikle 10 olan eşik değer (yoğunluk eşik) seçin. İstediğiniz piksel değeri (boyutu eşiğini, örneğin, 500) seçin. Elektronik tablo dosyası için hedef seçin çalıştırmak analiz ve günlük dosyaları daha sonra kaydedin. Elektronik tablodaki verileri analiz.