高スループット アッセイを行い好中球細胞外トラップ形成の定量化

すべての患者と健常者は、LUMC バイオバンクに参加に同意しました。両方の biobanking の研究は、LUMC 倫理委員会で承認されました。 1. 健康的な好中球の隔離 2 つの 10 mL EDTA 被覆管の健康なドナーから末梢血 20 mL を取得します。 滅菌 50 mL のチューブに血液の 10 mL を入れ、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を追加 32.5 mL。 セルの下で密度勾配 (例えば.、Ficoll amidotrizoaat) を追加します。 10 mL のピペット ピペット コント ローラーとグラデーション密度 14 mL をとる。 50 mL チューブの底に、ピペットを配置します。 ピペットから重力によって流れる、毛細管現象によって最大値に到達するまでに密度勾配を許可するオフ、ピペット ピペット コント ローラー (1-2 の mL がままあります)、モーターを使用せず。 ピペット、ピペットの削除時に漏れてから防ぐ密度勾配の上に親指を置くことによってピペットを削除します。 912 × g室温 (RT) 加速やブレーキなしで 20 分の管をスピンします。注:赤い血球 (RBC)、好中球、高密度を持ち、50 mL のチューブの下部に。末梢血単核球 (PBMCs)、分離密度勾配の上に白色のリングとして。上記、PBMCs PBS 希薄プラズマになります。必要に応じて、PBMCs がホワイト リングを PBS で追加の洗浄のステップと新しい 50 mL チューブに移すことによって分離できます。 PBS 希薄プラズマと最後に可能な限り、密度勾配層の除去が続く最初、PBMCs を含むホワイト リングを慎重に取り外します。 好中球好中球/赤血球ミックスからを分離するには、冷滅菌水で赤血球を溶解させます。 冷滅菌蒸留水の水のボトルを取るし、10 倍濃縮冷蔵庫から PBS フラスコ。 すぐにこのステップの作業。36 mL のペレットの上に直接冷滅菌蒸留水を追加し、一度慎重に混ぜます。20 後 10 x PBS の 4 つの mL を追加する等張液 s。一度慎重に混ぜます。 (赤血球の除去) のための 4 ° C 739 x gで 5 分の管をスピンします。好中球は、白のペレットになります。 上澄みを慎重に廃棄します。1.6.2 の手順をもう一度実行し、ペレットが正常に中断されているかどうかを確認します。 328 × gで 5 分間、4 ° C のチューブをスピンします。 慎重に上澄みを除去し、5 mL の PBS でペレットを再懸濁します。好中球をカウントし、氷の上にそれらを保ちます。注:血液 10 mL 1 管から利回りは約 1500 万好中球です。 2. 赤い蛍光細胞が好中球のラベリング 15 mL チューブに 2 mL の PBS で 1000 万好中球好中球の懸濁液を作る。 2 μ M 赤色の蛍光細胞リンカーの 4 μ L で 2 mL の PBS 溶液を作ります (材料表参照) 別 15 mL チューブに。好中球の懸濁液にそっとこれを追加し、慎重に混ぜます。 暗闇のなかで赤色蛍光細胞リンカーと好中球のラベルに 37 ° C で正確 25 分間インキュベートします。 一度慎重に不活性、ラベリング RPMI 1640 培 10% 熱不活化牛胎児血清 (FCS) を追加することによって RT で最大 15 mL とミックス。ペレットは、ペレットが形成されている場合慎重に再停止されることを確認します。 328 x gおよび RT で 5 分間チューブをスピンします。 上澄みを除去し、フェノールレッド フリー RPMI 1640 5 mL にペレットを再懸濁します 10% と 2% の FCS を含む中室温 P/S カウント好中球。注:50% の細胞の損失は、赤い蛍光細胞ラベリング後発生します。 3. 好中球細胞外トラップ形成の誘導 無料 RPMI 1640 媒体含む 2% の FCS、10 %0.42 x 106セル/mL にフェノールレッドのセル中断を行う P/S. 90 μ L/黒 96 ウェル、フラット底板のウェルに 37,500 好中球を追加します。 井戸の 10% の濃度に到達する 3 通で選ばれた刺激 (例えば、患者の血清) の 10 μ L を追加します。ネガティブ コントロール (中) は、3 通常に。 希望の時間は、30 分から 2、4 または 6 h. 孵化 4 h が示唆されたために至るまで、37 ° C で暗闇の中で孵化させなさい。 必要な 25 を追加する 5 μ M 不浸透性 DNA の μ L を染める (材料の表を参照)、井戸の 1 μ M の最終濃度に到達する量を計算します。RPMI 1640 媒体含む 2% の FCS で 10%、predilution は必要に応じて行う P/S、濃度が 5 μ M。 インキュベーション時間の終わりの前に 5 μ M の不浸透性 DNA 染色 15 分の 25 μ L を追加します。暗闇の中で 37 ° C で別の 15 分間インキュベーションを続行します。 非常に慎重に上清 (~ 125 μ L) を削除し、必要な場合を格納します。4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 100 μ L を追加します。暗闇の中とすぐに手順 4 に進みます。 4 3 D の高いコンテンツは、高解像度蛍光共焦点顕微鏡を用いたネット可視化 蛍光共焦点顕微鏡を集録のセットアップをクリックして設定を構成します。 [構成] タブをクリックします。 目的は、カメラを選択します。共焦点 60 μ m のピンホールのアクイジション ・ モードと 10 倍 Apo ラムダ目的を選択します。 皿の上をクリックし、96 ウェル プラスチック プレートを選択します。サイトを訪問し、サイトの固定数を選択するを選択します。井戸の 45% の合計をカバーする (0 μ m) の重複なし 3 行と 3 列を入力します。 取得をクリックします。レーザー ベースの焦点を有効にするを選択します。必要な場合は、 Z シリーズ/時系列データの取得を選択します。 サイトのオート フォーカスをクリックします。 プレート下部にフォーカスをクリックして |底の厚みによってオフに設定します。サンプル プログラムを探し、最初の井戸を選択初期も取得しました。サイト オート フォーカスのためには、すべてのサイトを選択します。 波長をクリックします。 波長の数、2 を選択します。TL シェーディング補正洗練されたレベル 2 を選択します。 波長 1 テキサス赤を選択します。 オート フォーカス オプションは、Z オフセット、選択的レーザー ポスト レーザー オフセット 1.1 μ m。 使用 z カスタム範囲 200 – 10。 波長 2 FITC を選択します。 オート フォーカス オプションは、選択レーザー w1 から Z オフセット 0 μ m. 使用 z 200 10 のカスタム範囲で。 取得オプションの Z シリーズと最大 2 D 投影イメージを選択します。取得オプションを選択シェーディング補正 |オフ。 Z シリーズを選択します。ステップ数を選択: 10。選択ステップ サイズ: 3 mm (全範囲は 27 μ m になります)。 蛍光共焦点顕微鏡に皿を置きます。 [実行] タブをクリックします。 板名と説明を記入し、ストレージの場所を選択します。 井戸を取得する必要がありますを選択します。 テキサスの赤と FITC の露光時間を選択します。 プレートの取得買収は、プレートごと約 1 時間を取るを開始するをクリックします。 5. ネット形成過程の解析 画像処理プログラム (材料表参照) 科学的な多次元画像解析ネット形成を分析するために設計を使用します。 取得した画像データを別のハード ドライブに転送します。 ツールを追加する色を選択します。 W1 を選択し、データが格納されているハード ドライブのフォルダーを選択します。 W2 を選択し、データが格納されているハード ドライブのフォルダーを選択します。注:テキサス赤画像に赤い色を追加するファイル名で w1 を使用し FITC 画像に緑の色を追加する w2 を使用して標準的なマクロを使用します。 解析マクロを選択します。 W1を選択は通常 10 しきい値 (輝度しきい値) を選択します。目的のピクセル値 (例えば、100 サイズのしきい値) を選択します。 W2を選択は通常 10 しきい値 (輝度しきい値) を選択します。目的のピクセル値 (サイズのしきい値、500 など) を選択します。 スプレッドシート ファイルの保存先を選択して分析を実行し、その後ログ ファイルを保存します。 スプレッドシートでデータを分析します。