Induzione e punteggio della malattia di Graft-Versus-Host in un modello di Murine Xenogeneico e quantificazione delle cellule T umane nei tessuti del topo utilizzando pcR digitale

Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche allogeniche (HSCT) è diventato un trattamento di routine per i pazienti affetti da neoplasie ematologiche come la leucemia con prognosi infausta. Una complicazione significativa dell’HSCT è la malattia acuta di innesto contro l’ospite (GVHD). Uno studio del 2012 ha riferito che il GVHD acuto si è sviluppato nel 39% dei pazienti con HSCT che hanno ricevuto trapianti da donatori fratelli e 59% dei pazienti sottoposti a trapianto da donatori non correlati¹. Il GVHD acuto si verifica quando le cellule T derivate dal donatore attaccano gli organi del destinatario. L’unica terapia di successo per gVHD è il trattamento con farmaci altamente immunosoppressivi², che sono altamente tossici e aumentano il rischio di infezione e recidiva del tumore. Così, nonostante i miglioramenti che sono stati fatti nella sopravvivenza acuta GVHD negli ultimi anni^3,4,5, c’è ancora una necessità critica per il miglioramento delle terapie GVHD con tossicità minima che promuovono la remissione a lungo termine.

L’obiettivo generale dei seguenti metodi è quello di indurre e segnare GVHD xenogeneico (xenoGVHD). Il modello xenoGVHD è stato sviluppato come strumento per indurre GVHD acuto con cellule umane piuttosto che cellule murine permettendo una traduzione più diretta della ricerca GVHD pre-clinica agli studi clinici⁶. Questo modello prevede l’iniezione per via endovenosa di cellule mononucleari del sangue periferiche umane (PBMC) in topi NOD-SCID IL-2R – null (NSG) irradiati sublethaldalmente. Le cellule T umane iniettate vengono attivate da cellule che presentano antigene umano (APC) che presentano l’antigene murno e le cellule T attivate migrano verso tessuti distanti con conseguente infiammazione sistemica e infine la morte^{6,7, 8} (IN vio ^{, 9} (in vie ^{, 10}. La patologia della malattia e la progressione nel modello xenoGVHD imitano strettamente il GVHD acuto umano. In particolare, le cellule T umane patogene sono reattive a murine principali proteine complesse di istocompatibilità (MHC), che è simile all’alloreattività delle cellule T nel GVHD umano^6,9. Il vantaggio principale del modello xenoGVHD rispetto al modello di mismatch MHC del mouse, l’altro modello GVHD ampiamente usato, è che consente di testare le terapie sulle cellule umane piuttosto che sulle cellule murine. Ciò consente di testare i prodotti che possono essere tradotti direttamente in clinica senza alcuna modifica perché sono fatti per indirizzare le cellule umane. Recentemente, questo modello è stato utilizzato per testare un anti-IL-2 umano¹¹, cellule T regolatorie umane (Tregs)¹² e cellule staminali mesenchymiche umane¹³ come potenziali trattamenti per la GVHD acuta. In un contesto più ampio, questo modello può essere utilizzato come un saggio di soppressione in vivo per qualsiasi farmaco o tipo di cellula che può sopprimere l’attività delle cellule T umane. Ad esempio, Stockis et al.¹⁴ hanno utilizzato il modello xenoGVHD per studiare l’effetto del blocco dell’attività soppressiva di Treg in vivo. Pertanto, il modello xenoGVHD può fornire informazioni sul meccanismo di qualsiasi terapia mirata alle cellule T in un ambiente in vivo.

Un ulteriore metodo descritto in questo protocollo è come rilevare le cellule T umane nei tessuti dei topi utilizzando la reazione a catena di polimerasi digitale (dPCR). L’obiettivo di questo metodo è quello di offrire uno strumento per quantificare la migrazione e la proliferazione delle cellule T nei tessuti bersaglio, che misurano l’efficacia delle terapie immunosoppressive testate in questo modello. dPCR è un metodo relativamente nuovo per la quantificazione degli acidi nucleici¹⁵. In breve, la miscela di reazione PCR è divisa in partizioni che contengono piccoli numeri della sequenza di destinazione o nessun bersaglio a tutti. La sequenza bersaglio viene quindi amplificata e rilevata utilizzando coloranti intercalari del DNA o sonde fluorescenti specifiche del bersaglio. dPCR quantifica il numero di copie della sequenza di destinazione in base alla frazione di partizioni positive e alle statistiche di Poisson^15,16. Il rilevamento delle cellule T con dPCR richiede molto meno tessuto rispetto ad altri metodi alternativi, tra cui citometria di flusso e istologia, e può essere eseguito su tessuto congelato o fisso. dPCR non richiede una curva standard per determinare i numeri di copia, né sono necessarie repliche tecniche. In questo modo si riduce la quantità di DNA di reagente e modello necessaria per il dPCR rispetto al tradizionale PCR quantitativo (qPCR)¹⁶. Partizionare la reazione PCR in sottoreazioni in dPCR concentra efficacemente gli obiettivi¹⁷. Pertanto, dPCR è principalmente uno strumento per il rilevamento di bersagli rari in una grande quantità di DNA non bersaglio. Ad esempio, dPCR viene utilizzato per rilevare la contaminazione batterica nel latte¹⁸, identificare rare mutazioni nel gene del recettore degli estrogeni¹⁹e rilevare il DNA tumorale circolante nel sangue dei pazienti²⁰. In questo protocollo, dPCR funge da strumento efficiente per rilevare e quantificare le cellule T umane nei tessuti di topi con xenoGVHD.